[发明专利]化学合成的金黄色葡萄球菌的表面蛋白FnBPA基因片段及其表达、应用

权利要求书

1.一种化学合成的金黄色葡萄球菌表面蛋白FnBPA的基因片段，该基因片段编码含强抗原表位的金黄色葡萄球菌表面蛋白FnBPA基因片段，即第745个氨基酸至第877个氨基酸，共133个氨基酸，在该基因片段的5'端增加了BamH I酶切位点（下划线部分），在3'端增加了终止密码子TGA和Xho I酶切位点（下划线部分），化学合成的基因序列全长414bp，序列如下：

GGATCC  GGT CAG AAC AGC GGT AAC CAG TCG TTT GAA GAA GAC ACG GAA GAA GAT AAG CCG AAG TAT GAA CAG GGT GGC AAC ATT GTG GAC ATT GAT TTT GAC AGT GTC CCG CAG ATT CAT GGC CAA AAC AAA GGT AAT CAG TCC TTC GAA GAA GAC ACC GAA AAA GAT AAG CCG AAA TAT GAA CAC GGC GGT AAC ATT ATC GAT ATT GAC TTT GAT AGC GTT CCG CAT ATC CAC GGC TTC AAC AAG CAT ACC GAA ATT ATC GAA GAA GAC ACG AAT AAG GAT AAA CCG AGC TAC CAA TTT GGC GGT CAC AAT TCT GTG GAC TTC GAA GAA GAT ACG CTG CCG AAA GTT TCC GGT CAG AAC GAA GGC CAG CAG ACG ATT GAA GAA GAC ACG ACG CCG CCG ATT GTT TGA CTCGAG。

2.权利要求1所述的化学合成的金黄色葡萄球菌表面蛋白FnBPA的基因片段，采用基因工程技术表达该基因序列编码的金黄色葡萄球菌表面蛋白FnBPA基因片段，纯化表达的蛋白片段，具体方法如下：

金黄色葡萄球菌表面蛋白FnBPA基因片段重组质粒的构建:

用 BamH I和Xho I双酶切质粒pGEX4T-2和化学合成的金黄色葡萄球菌表面蛋白FnBPA基因片段，电泳回收后，用T4 DNA 连接酶连接，使金黄色葡萄球菌表面蛋白FnBPA基因片段插入到载体pGEX4T-2内的BamH I和Xho I位点之间，与载体上的起始密码子翻译框架一致，表达一个融合蛋白，全长359个氨基酸,该融合蛋白N端融合了载体上的226个氨基酸，C端包含金黄色葡萄球菌表面蛋白FnBPA内的第745个氨基酸至第877个氨基酸，全长氨基酸序列如下：

Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu Val Cys Phe Lys

Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly Gln Asn Ser Gly Asn Gln Ser Phe Glu Glu Phe Thr Glu Glu Asp Lys Pro Lys Tyr Glu Gln Gly Gly Asn Ile Val Asp Ile Asp Phe Asp Ser Val Pro Gln Ile His Gly Gln Asn Lys Gly Asn Gln Ser Phe Glu Glu Asp Thr Glu Lys Asp Lys Pro Lys Tyr Glu His Gly Gly Asn Ile Ile Asp Ile Asp Phe Asp Ser Val Pro His Ile His Gly Phe Asn Lys His Thr Glu Ile Ile Glu Glu Asp Thr Asn Lys Asp Lys Pro Ser Tyr Gln Phe Gly Gly His Asn Ser Val Asp Phe Glu Glu Asp Thr Leu Pro Lys Val Ser Gly Gln Asn Glu Gly Gln Gln Thr Ile Glu Glu Asp Thr Thr Pro Pro Ile Val

表达融合蛋白工程菌的筛选鉴定:

将重组质粒转化大肠杆菌BL21，涂布含100μg／ml氨苄青霉素的LB平板，置37℃ 过夜，次日随机挑取转化菌落和含质粒pGEX4T-2的对照菌，提取质粒 ，双酶切验证,切出414bp的目的条带；将含有外源基因的质粒进行DNA序列分析，序列分析证实重组质粒含有金黄色葡萄球菌fnbpa基因片段，序列完全正确；将含有重组质粒的阳性转化子，接种至含氨苄青霉素100μg／mL 的LB培养基内，37℃振荡培养4h，加IPTG至终浓度0.2 mmol/L,继续振荡培养诱导4h，离心收集菌体进行SDS-PAGE检测,重组子表达相对分子量约为42 kD的金葡菌表面蛋白FnBPA，表达量约为20%，而含空质粒pGEX4T-2的对照菌无此蛋白带；

表达金黄色葡萄球菌表面蛋白FnBPA的纯化：

将诱导表达融合蛋白的工程菌离心，收菌，菌体重悬于裂解液（20mmol/L PB pH8.0、10 mmol/L EDTA、1mmol/L DTT、5%甘油），冰浴超声破菌75次，离心收集上清，上清溶液加已经平衡的High-Affinity GSH Resin凝胶10ml，4℃结合过夜,上样，收集穿透液；用十倍柱床体积的1×PBS洗涤柱子，接着用50ml高浓度的GSH洗脱液（50 mmol/L Tris-HCl pH8.0 + 10 mmol/L GSH）分三次洗脱目的蛋白,即为纯化的金葡菌FnBPA蛋白片段。