[发明专利]化学合成的金黄色葡萄球菌的表面蛋白FnBPA基因片段及其表达、应用

说明书

技术领域

本发明涉及的是化学合成的金黄色葡萄球菌的表面蛋白FnBPA基因片段及其表达、应用，利用基因工程技术，制备重组金黄色葡萄球菌的表面蛋白FnBPA。通过计算机分析，筛选出含强抗原表位的FnBPA片段，选择原核生物偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，利用基因工程技术表达，表达的蛋白可用于疫苗及金黄色葡萄球菌快速检测方法的建立等，本发明涉及基因工程技术和诊断试剂领域。

背景技术

金黄色葡萄球菌是一种能引起人类和动物疾病的条件致病菌。它作为正常菌群寄生于人类皮肤和粘膜表面，占医院感染和社区获得性感染的大部分。金葡菌能引起皮肤和软组织感染，以及危及生命的转移性并发症，如肺炎、菌血症，心内膜炎，化脓性关节炎和骨髓炎，它广泛存留于医院，引起免疫系统损伤的宿主和手术病人感染，并存留医疗器械中。金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到，因此，奶、肉、蛋、鱼及其制品等食品受其污染的机会很多。金黄色葡萄球菌也是各级卫生机构重点检测的病原体之一。因此，建立金黄色葡萄球菌的快速检测方法非常重要。 

     传统鉴定和分离金黄色葡萄球菌的方法步骤较多，并且具有一定的局限性。首先要根据被检测的致病菌类型对样品进行富集培养，其鉴定结果一般只能定性不能定量，并且所需时间长，速度慢，一般3~4d才能推测结果，准确鉴定需要5~7天。大多数免疫学技术例如荧光标记抗体实验、酶联免疫试验（ELISA）、放射性免疫试验等都得到广泛应用，但它们所需成本较高、耗时且对样品进行复杂的处理，限制其在生活中的广泛应用。建立一种简单、快速、适合现场应用的金黄色葡萄球菌的检测方法有重要的意义。

发明内容

本发明是化学合成的金黄色葡萄球菌表面蛋白FnBPA的全新基因片段，利用基因工程技术，制备重组金黄色葡萄球菌的FnBPA的部分片段。通过计算机分析，筛选出含强抗原表位的金黄色葡萄球菌表面蛋白FnBPA的部分片段 ,第745个氨基酸－第877个 氨基酸，共133个氨基酸，选择原核生物偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，利用基因工程技术在大肠杆菌BL21中表达该基因。表达的蛋白可用于单克隆抗体和多克隆抗体的制备，为金黄色葡萄球菌检测方法的建立奠定了基础。

金黄色葡萄球菌产生的细胞外结合基质蛋白（ECMBP），包括FnBP、ClfA 和Ebp等，它们均为细菌表面的蛋白成分，具有相似的结构。FnbpA是纤连蛋白结合蛋白（ Fnbp）的一种，是细菌表面的蛋白质成分。通过对金黄色葡萄球菌临床分离株Fnbp的双重PCR检测，发现95%以上的菌株存在粘附素基因FnbpA而FnbpB基因仅有10%，本研究选用FnBPA作为研究对象。

通过计算机软件分析，筛选出金黄色葡萄球菌的特异性表面蛋白FnPFA抗原表位富集区，选择原核生物偏爱的密码子优化基因序列，化学合成全新的基因序列，利用基因工程技术表达。表达的蛋白具有较好的抗原性和特异性，可用于单克隆抗体和多克隆抗体的制备，为金黄色葡萄球菌快速检测方法的建立奠定基础。

化学合成的金黄色葡萄球菌表面蛋白FnBPA的133个氨基酸的基因片段及其表达、应用是采取以下步骤实现的：

1．金黄色葡萄球菌表面蛋白FnBPA抗原表位的筛选及其基因片段的化学合成：

利用ANTHEWIN、DNAStar等软件，通过计算机分析金葡菌表面蛋白FnBPA的全氨基酸序列， 发金葡菌表面蛋白FnBPA的N端（第745氨基酸 — 第877 氨基酸）含有较强的抗原决定簇。选择原核生物偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，并且在5'端增加了BamH I酶切位点（下画线部分），在3'端增加了终止密码子（TGA）和Xho I酶切位点（下画线部分），使该基因片段易于克隆至质粒pGEX4T-2的BamH I和Xho I酶切位点内。

筛选的金黄色葡萄球菌表面蛋白FnBPA内的抗原表位氨基酸序列（第745个aa－第877个aa）：