[发明专利]化学合成的金黄色葡萄球菌的表面蛋白ClfA基因片段及其表达、应用

权利要求书

1.一种化学合成的金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA的基因片段，该基因片段编码含强抗原表位的金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA基因片段，即第40个氨基酸至第194个氨基酸，共155个氨基酸，在该基因片段的5'端增加了BamH I酶切位点，在3'端增加了终止密码子TAA和Xho I酶切位点，化学合成的基因序列全长480bp，序列如下：

GGATCC  AGC GAA AAT AGC GTG ACC CAA AGC GAC TCC GCC TCA AAC GAA AGC AAA TCC AAT GAC TCA AGT TCT GTC TCA GCA GCA CCG AAG ACG GAT GAC ACC AAT GTC TCG GAT ACG AAA ACC AGC TCT AAC ACG AAC AAT GGC GAA ACC AGC GTG GCG CAG AAT CCG GCC CAG CAA GAA ACC ACG CAA AGT TCC TCA ACC AAC GCG ACC ACG GAA GAA ACG CCG GTT ACC GGT GAA GCC ACC ACG ACC ACG ACC AAC CAG GCA AAT ACG CCG GCT ACG ACC CAA TCG AGC AAC ACC AAT GCA GAA GAA CTG GTC AAT CAG ACC TCT AAC GAA ACG ACC TTT AAC GAC ACG AAT ACC GTG TCT AGT GTT AAT TCC CCG CAG AAC TCA ACC AAT GCC GAA AAC GTG TCA ACG ACC CAG GAT ACC AGC ACG GAA GCG ACC CCG AGC AAC AAC GAA TCA GCA CCG CAG TCA ACC TAA CTCGAG 。

2.权利要求1所述的化学合成的金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA的基因片段，采用基因工程技术表达该基因序列编码的金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA基因片段，纯化表达的蛋白片段，具体方法如下：

金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA基因片段重组质粒的构建:

用 BamH I和Xho I双酶切质粒pGEX4T-2和化学合成的金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA基因片段，电泳回收后，用T4 DNA 连接酶连接，使金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA基因片段插入到载体pGEX4T-2内的BamH I和Xho I位点之间，与载体上的起始密码子翻译框架一致，表达一个融合蛋白，全长381个氨基酸,该融合蛋白N端融合了载体上的226个氨基酸，C端包含金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA内的第40个氨基酸至第194个氨基酸，全长氨基酸序列如下：

Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg Gly Ser Ser Glu Asn Ser Val Thr Gln Ser Asp Ser Ala Ser Asn Glu Ser Lys Ser Asn Asp Ser Ser Ser Val Ser Ala Ala Pro Lys Thr Asp Asp Thr Asn Val Ser Asp Thr Lys Thr Ser Ser Asn Thr Asn Asn Gly Glu Thr Ser Val Ala Gln Asn Pro Ala Gln Gln Glu Thr Thr Gln Ser Ser Ser Thr Asn Ala Thr Thr Glu Glu Thr pro Val Thr Gly Glu Ala Thr Thr Thr Thr Thr Asn Gln Ala Asn Thr pro Ala Thr Thr Gln Ser Ser Asn Thr Asn Ala Glu Glu Leu Val Asn Gln Thr Ser Asn Glu Thr Thr Phe Asn Asp Thr Asn Thr Val Ser Ser Val Asn Ser Pro Gln Asn Ser Thr Asn Ala Glu Asn Val Ser Thr Thr Gln Asn Thr Ser Thr Glu Ala Thr Pro Ser Asn Asn Glu Ser Ala Pro Gln Ser Thr

表达融合蛋白工程菌的筛选鉴定:

将重组质粒转化大肠杆菌BL21，涂布含100μg／ml氨苄青霉素的LB平板，置37℃ 过夜，次日随机挑取转化菌落和含质粒pGEX4T-2的对照菌，提取质粒 ，双酶切验证,切出480bp的目的条带；将含有外源基因的质粒进行DNA序列分析，序列分析证实重组质粒含有金黄色葡萄球菌ClfA基因片段，序列完全正确；将含有重组质粒的阳性转化子，接种至含氨苄青霉素100μg／mL 的LB培养基内，37℃振荡培养4h，加IPTG至终浓度0.2 mmol/L,继续振荡培养诱导4h，离心收集菌体进行SDS-PAGE检测,重组子表达相对分子量约为42 kD的金葡菌表面蛋白ClfA，表达量约为25%，而含空质粒pGEX4T-2的对照菌无此蛋白带；

表达金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA的纯化：

将诱导表达融合蛋白的工程菌离心，收菌，菌体重悬于裂解液，裂解液为20mmol/L PB pH8.0、10mmol/L EDTA、1mmol/L DTT、5%甘油，冰浴超声破菌75次，离心收集上清，上清溶液加已经平衡的High-Affinity GSH Resin凝胶10ml，4℃结合过夜,上样，收集穿透液；用十倍柱床体积的1×PBS洗涤柱子，接着用50ml高浓度的GSH洗脱液，洗脱液为50 mmol/L Tris-HCl pH8.0 + 10 mmol/L GSH，分三次洗脱目的蛋白,即为纯化的金葡菌ClfA蛋白片段。