[发明专利]化学合成的金黄色葡萄球菌的表面蛋白ClfA基因片段及其表达、应用

说明书

技术领域

本发明涉及的是化学合成的金黄色葡萄球菌的表面蛋白ClfA基因片段，利用基因工程技术，制备重组金黄色葡萄球菌的表面蛋白ClfA。通过计算机分析，筛选出含强抗原表位的ClfA片段，选择原核生物偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，利用基因工程技术表达，表达的蛋白可用于疫苗及金黄色葡萄球菌快速检测等，本发明涉及基因工程技术和诊断试剂领域。

背景技术

金黄色葡萄球菌是一种重要的人兽共患病原菌，是一种世界公认的导致人类和动物化脓性疾病的致病因子，也是引起食物中毒的重要因子。它能导致皮肤和软组织感染以及危及生命的菌血症转移性并发症，如肺炎、心内膜炎、化脓性关节炎和骨髓炎。金黄色葡萄球菌在医院内是一个可以检测的病原体，它会导致免疫功能低下的宿主、手术病人和留置医疗设备感染。

    传统鉴定和分离金黄色葡萄球菌的方法步骤较多，并且具有一定的局限性。大多数免疫学技术例如荧光标记抗体实验、酶联免疫试验（ELISA）、放射性免疫试验等都得到广泛应用，但它们所需成本较高、耗时且需对样品进行复杂的处理，限制其在生活中的广泛应用。建立一种简单、快速、适合现场应用的金黄色葡萄球菌的检测方法有重要的意义。

金黄色葡萄球菌产生的细胞外结合基质蛋白（ECMBP），包括FnBP、ClfA 和Ebp等，它们均为细菌表面的蛋白成分，具有相似的结构。其中， ClfA在细菌生长的各个阶段都出现，且几乎存在于所有金黄色葡萄球菌表面，是金黄色葡萄球菌表面重要的粘附素，可介导金黄色葡萄球菌粘附到宿主基质蛋白上，这是金黄色葡萄球菌感染的重要一步。金黄色葡萄球菌在生长期内都有产生ClfA，静止期内大量表达。不同菌株中ClfA的功能结构域高度保守，促使ClfA成为金黄色葡萄球菌抗体研究中的热门粘附因子。有报告指出，用免疫荧光技术分析野生型NewMan株和clfa::Tn917 NewMan突变株抗ClfA A区是裸露在细菌细胞表面的。通过用试纸条检测金黄色葡萄球菌菌液的阳性结果可以说明CIfA蛋白很可能是暴露与金黄色葡萄球菌加膜外蛋白或者说不被荚膜完全遮蔽。

发明内容

本发明是化学合成的金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA的全新基因片段，利用基因工程技术，制备重组金黄色葡萄球菌的ClfA的部分片段。通过计算机分析，筛选出含强抗原表位的金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA的部分片段 ,第40个氨基酸--第194个 氨基酸，共155个氨基酸，选择原核生物偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，利用基因工程技术在大肠杆菌BL21(DE3)中表达该基因。表达的蛋白可用于疫苗，亦可用于单克隆抗体和多克隆抗体的制备为金黄色葡萄球菌检测方法的建立奠定了基础。

通过计算机软件分析，筛选出金黄色葡萄球菌的特异性表面蛋白ClfA抗原表位富集区，选择原核生物偏爱的密码子优化基因序列，化学合成全新的基因序列，利用基因工程技术表达。表达的蛋白具有较好的抗原性和特异性，可用于单克隆抗体和多克隆抗体的制备，组装胶体金试剂条，为金黄色葡萄球菌快速检测方法的建立奠定基础。

化学合成的金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA的155个氨基酸的基因片段及其表达、应用是采取以下步骤实现的：                                                                                                         

1．金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA抗原表位的筛选及其基因片段的化学合成：

利用ANTHEWIN、DNAStar等软件，通过计算机分析金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA的全氨基酸序列，发现金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA的N端（第40氨基酸 — 第194 氨基酸）含有较强的抗原决定簇。选择原核生物偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，并且在5'端增加了BamH I酶切位点（下画线部分），在3'端增加了终止密码子（TGA）和Xho I酶切位点（下画线部分），使该基因片段易于克隆至质粒pGEX4T-2的BamH I和Xho I酶切位点内。

筛选的金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA内的抗原表位氨基酸序列（第40个aa－第194个aa）：