[发明专利]固定化土曲霉脂肪酶的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于化学合成领域，具体涉及固定化土曲霉脂肪酶的制备方法及其应用。

背景技术

游离的酶稳定性差，而且在实际工业应用中不能回收利用，酶的固定化技术使酶克服了这些缺点。目前，酶的固定化技术主要分为四类：吸附法，包埋法，交联法和共价结合法。吸附法是通过离子作用或物理吸附将酶固定到载体上，操作简单，条件温和，对酶活保持较好，但是由于物理吸附作用力弱，固定的酶容易流失，工业应用在一定程度上受到了限制。交联法是通过双功能或多功能试剂使酶分子之间交联实现固定化，虽然固定的酶很牢固但由于交联的条件苛刻，酶分子通常失活很严重。共价结合法通过双功能试剂将酶分子与载体连接起来，操作比较复杂，容易破坏酶的部分活性中心。包埋法是将酶分子包埋在凝胶网格或高分子囊腔中，虽然只适合小分子底物和产物，但是其固定化条件温和，对酶的结构影响小，酶活保持较好。

酮洛芬作为一种非甾体抗炎药，其中只有S-构型才具有广泛的抗炎镇痛的作用，R-构型的酮洛芬只对治疗牙痛有用。目前酮洛芬被广泛用于治疗类风湿性关节炎、风湿性关节炎、骨关节炎、关节强硬性脊椎炎及痛风等。根据已有报道，将酮洛芬制成酯类衍生物可以增加生物应用性（Bonina F P,Montenegro L,Guerrera F.Naproxen1-alkylazacycloalkan-2-one esters as dermal prodrugs:in vitro evaluation[J].International journal of pharmaceutics,1993,100(1):99-105.）。并且，S-构型的酮洛芬乙烯酯可以作为一种前药或者重要聚合物药物的单体（Cai X Q,Chen Z C,Wang N,et al.A facile method for preparation of polymerizable,optically active ketoprofen prodrug by irreversible lipase-catalysed resolution[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2006,22(7):723-727.）。

选择性的水解消旋的酮洛芬乙烯酯，可以得到R-构型的酮洛芬乙烯酯和S-构型的酮洛芬，或者S-构型的酮洛芬乙烯酯和R-构型的酮洛芬。目前，获得单一构型酮洛芬的方法有结晶法，动力学拆分法，不对称合成法和色谱分离法。其中，动力学拆分是最为广泛使用的方法。与化学催化剂相比，酶法拆分具有更大的优势。在酶促动力学拆分中，对映选择性水解是常用方法之一。酮洛芬乙烯酯被选为对映选择性水解的底物，是因为其水解生成的醇可以通过互变异构体成为乙醛，使水解过程不可逆，并且易于分离。Zhong Ni等人用固定化的枯草芽孢杆菌脂肪酶A催化酮洛芬乙烯酯的水解（Ni Z,Zhou P,Jin X,et al.Integrating in silico and in vitro approaches to dissect the stereoselectivity of Bacillus subtilis lipase a toward Ketoprofen Vinyl Ester[J].Chemical Biology&Drug Design,2011,78(2):301-308.），产物的对映体过量（ee值）为93%，但是转化率只有20.3%，并且没有对固定化的枯草芽孢杆菌脂肪酶A进行回收。

本发明采用的Alg-g-mPEG（海藻酸钠接枝聚乙二醇单甲醚）的制备方法为：将Boc（叔丁氧羰基保护）的甘氨酸与mPEG2000（聚乙二醇单甲醚2000）反应，得到Boc保护甘氨酸修饰的mPEG2000；再脱去Boc保护基，得到端氨基修饰的mPEG2000；将端氨基修饰的mPEG2000与海藻酸钠反应，得到Alg-g-mPEG。上述Alg-g-mPEG的制备方法参见Meng X W,Qin J,Liu Y,et al.Degradable hollow spheres based on self-assembly inclusion[J].Chemical Communications,2010,46(4):643-645。

发明内容

本发明要解决的技术问题是游离的土曲霉脂肪酶稳定性差、不能回收利用，现有的酮洛芬乙烯酯水解方法产率低。