[发明专利]一种耐高温脂肪酶及其编码产物

权利要求书

1.一种耐高温脂肪酶，其特征在于：其核苷酸序列如下：

或者，其氨基酸序列如下：

2.一种根据权利要求1所述耐高温脂肪酶的宏基因组学克隆方法，其特征在于：其步骤包括：提取红树林植物根泥土壤样品的总DNA，并将得到的总DNA纯化；将纯化后的总DNA经Bam HI内切酶酶切，连接至载体pUC118/Bam HI，电击转化至大肠杆菌DH5α超级感受态建立宏基因组文库，通过点在以三丁酸甘油酯为筛选底物的LB固体平板，筛选有水解圈的单菌落得到阳性克隆子。

3.一种根据权利要求1所述耐高温脂肪酶DNA的重组质粒，其特征在于：是根据脂肪酶基因lip906的序列设计引物，以提取的质粒pUC118-lip906为模板，进行PCR扩增，PCR产物经凝胶电泳并回第一收产物，凝胶回收的第一产物经限制性内切酶EcoRI、HindIII双酶切并第二回收产物，质粒pET32a经EcoRI、HindIII双酶切后与第二回收产物连接，获得连接产物，为重组质粒pET32a-lip906；其中，所述序列设计引物序列如下：

lip906-F:5’CCGGAATTC ATGACAACAC CAGCAGCTAC CATCGAA GG3’；lip906-R:5’CCCAAGCTT TCAGGGGCAAACACCGGTGGG3’。

4.一种含有权利要求1所述耐高温脂肪酶DNA的表达载体，其特征在于：构建方法包括：采用电转法，将上述耐高温脂肪酶基因的重组质粒转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中，将细菌悬浮液恢复培养并稀释涂布于氨苄青霉素抗性培养板上培养，挑取阳性转化子。

5.一种重组脂肪酶，其特征在于：是用权利要求4所述含有耐高温脂肪酶DNA的表达载体转化宿主菌细胞，培养转化体，从培养物中获得的。

6.根据权利要求5所述一种重组脂肪酶，其特征在于：所述宿主菌是大肠杆菌BL21。

7.根据权利要求5或者6所述一种重组脂肪酶的制备方法，其特征在于：其包括的步骤如下：用所述耐高温脂肪酶DNA的重组质粒转化的大肠杆菌涂布于含氨苄青霉素抗性的平板上，培养过夜，挑取单克隆接种于LB液体培养基，振荡培养过夜，转接至新鲜的含氨苄青霉素抗性LB培养基，培养至OD₆₀₀=0.8，加入IPTG诱导培养；培养后经镍柱亲和层析纯化。

8.根据权利要求7所述一种重组脂肪酶的制备方法，其特征在于：其包括的步骤如下：用所述耐高温脂肪酶DNA的重组质粒转化的大肠杆菌涂布于含氨苄青霉素抗性的平板上，37℃倒置培养过夜，挑取单克隆接种于LB液体培养基，37℃、以转速为180rpm振荡培养过夜，按体积比1：100的比例转接至新鲜的含氨苄青霉素抗性LB培养基，于37℃、转速为180rpm培养至OD₆₀₀=0.8，加入IPTG诱导培养培养后经镍柱亲和层析纯化。

9.根据权利要求8所述一种重组脂肪酶的制备方法，其特征在于：所述IPTG终浓度为1mM，诱导温度为30℃。

10.根据权利要求8所述一种重组脂肪酶的制备方法，其特征在于：所述IPTG终浓度为0.08～0.1mM，诱导温度为25～37℃。