[发明专利]一种耐高温脂肪酶及其编码产物

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种利用宏基因组文库筛选的方法从红树林土壤微生物中获得一种耐高温脂肪酶及其编码产物。

背景技术

脂肪酶(Lipase,EC3.1.1.3)是一类能催化长链脂肪酸酯水解、合成和酯交换的酶类，具有广泛的底物特异性、高度的位置选择性和异构体选择性等特点，应用前景广泛。在食品行业应用于食用油脂的转化、乳制品工业以及食品添加剂工业中；医药行业用于手性药物的合成和旋光异构体的拆分中；生物能源行业用其催化动物油脂、植物油等与甲醇或乙醇进行酯交换反应，进而得到脂肪酸甲酯或脂肪酸乙酯等生物燃料；洗涤业和纺织工业也广泛使用脂肪酶。深入开展脂肪酶的研究具有重要的理论意义和广阔的应用前景。

上述各种工业应用均要求脂肪酶在不同反应条件下与不同的底物作用，如制浆需要脂肪酶在高盐碱和高温的环境下作用，然而目前所研究的脂肪酶的酶学性质在应用方面仍然存在缺陷，限制了脂肪酶的广泛应用。因此，如何从环境中获得具有优良特性的脂肪酶，并研究其结构与功能之间的关系，是当前在脂肪酶研究中面临的一项重要任务。

自然界中存在的微生物99%是不可培养的,因此从用传统的培养技术分离到的微生物中筛选新的生物催化剂的方法是非常有局限性的。利用免陪养技术-宏基因组技术(Metagenomics)，直接从环境中提取DNA，将其克隆到不同的载体中，构建宏基因组文库,再从中进行筛选。该技术在挖掘和利用未培养微生物资源和筛选新颖生物活性物质方面表现出巨大的潜力，已成为当前国际上微生物学研究的前沿领域和热点。至今国内外学者已经通过该技术克隆到如淀粉酶、木聚糖酶、纤维素酶、酯酶等新基因，这些酶具有新颖的酶学特性及工业应用潜力。因此该方法为发现脂肪酶新基因提供了新思路。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种耐高温、高稳定性的耐高温脂肪酶。

本发明的第二个目的在于提供上述耐高温脂肪酶的宏基因组学克隆方法。

本发明的第三个目的在于提供一种耐高温重组脂肪酶基因的重组质粒pET32a-lip906。

本发明的第四个目的在于提供一含有上述耐高温脂肪酶DNA的表达载体。

发明的第五个目的在于提供一种耐高温重组脂肪酶及其制备方法。

本发明的第一个目的是通过如下技术方案来实现的：一种耐高温脂肪酶基因，所述脂肪酶基因命名为lip906，其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1所示。

本发明提供的上述新型脂肪酶，它的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第一个目的是通过如下技术方案来实现的：一种耐高温脂肪酶，其核苷酸全长序列（命名为lip906）如下（SEQ ID NO. 1）如下：

或者，所述耐高温脂肪酶的氨基酸序列如下（SEQ ID NO. 2）：

上述耐高温脂肪酶基因表达的产物具有较高的催化活性，具有良好的耐高温及热稳定性特性，具有较大的工业化生产和应用潜力。

一种耐高温脂肪酶的宏基因组学克隆方法，其步骤包括：

提取红树林植物根泥土壤样品的总DNA，并将得到的总DNA纯化；将纯化后的总DNA经Bam HI内切酶在30℃酶切6h，连接至载体pUC118/ Bam HI (BAP)，电击转化至大肠杆菌DH5α超级感受态建立宏基因组文库，通过点在以三丁酸甘油酯为筛选底物的LB固体平板，筛选有水解圈的单菌落即得到阳性克隆子，经测序、pBLAST及ORF Finder分析并设计引物，从而克隆到目的片段。

所述耐高温脂肪酶DNA的重组质粒pET32a-lip906，是根据脂肪酶基因lip906的序列设计引物，以提取的质粒pUC118-lip906为模板，进行PCR扩增，PCR产物经凝胶电泳并回收产物1，凝胶回收产物1经限制性内切酶EcoRI、HindIII双酶切并回收产物2，质粒pET32a经EcoRI、HindIII双酶切后与回收产物2连接，获得连接产物，即重组质粒pET32a-lip906；所述序列设计引物序列如下：

lip906-F: 5’ CCGGAATTC ATGACAACAC CAGCAGCTAC CATCGAA GG 3’ ；

lip906-R:5’CCCAAGCTT TCAGGGGCAAACACCGGTGGG3’；