[发明专利]化学合成的肺炎链球菌PspA蛋白胞外区基因片段及其表达、应用

权利要求书

1.一种化学合成的肺炎链球菌PspA蛋白的胞外区基因片段，该基因片段编码含强抗原表位肺炎链球菌PspA蛋白胞外区基因片段，即第33个氨基酸至第109个 氨基酸，共77个氨基酸，在该基因片段的5'端增加了BamHI酶切位点（下划线部分），在3'端增加了终止密码子TGA和EcoRI酶切位点（下划线部分），化学合成的基因序列全长246bp，序列如下：

GGATCC GAA GCC CCG GTT GCC AGC CAA TCG AAG GCG GAA AAA GAC TAC GAC GCA GCC GTG AAG AAA AGC GAA GCA GCG AAA AAA GCA TAC GAA GAA GCA AAA AAG AAA GCG GAA GAT GCC CAG AAG AAA TAC GAT GAA GAC CAA AAG AAA ACC GAA GAA AAA GCG GAA AAC GAA AAG AAA GCG GCG GCA GAC CTG AAT GAA GCG ACC GAA GTC CAT CAA AAG GCG TAT GTG CGT TAC TAA CTCGAG

权利要求1所述的化学合成的基因片段，采用基因工程技术表达该基因序列编码的肺炎链球菌PspA蛋白胞外区基因片段，纯化表达的蛋白片段，具体方法如下：

表达肺炎链球菌PspA蛋白胞外区基因片段重组质粒的构建:

用 Bam HI和EcoR I双酶切质粒pGEX4T-2和化学合成的肺炎链球菌PspA蛋白胞外区基因片段，电泳回收后，用T4 DNA 连接酶连接，使肺炎链球菌PspA蛋白胞外区基因片段插入到载体pGEX4T-2内的BamH I和EcoR I位点之间，与载体上的起始密码子翻译框架一致，表达一个融合蛋白，全长303个氨基酸,该融合蛋白N端融合了载体上的226个氨基酸，C端包含肺炎链球菌PspA蛋白胞外区基因片段，电泳回收后，用T4 DNA 连接酶连接，使肺炎链球菌PspA蛋白内的第33个氨基酸至第109个氨基酸链接到载体质粒，全长氨基酸序列如下：

表达融合蛋白工程菌的筛选鉴定:

　　将重组质粒转化E. coli BL21(DE3)，涂布含100μg／ml氨苄青霉素的LB平板，置37℃ 过夜，次日随机挑取转化菌落和含质粒pGEX4T-2的对照菌，提取质粒 ，用限制性内切酶BamHI和XhoI对质粒双酶切，1.0％的Agarose凝胶检测双酶切产物应切下约220bp的基因片段。

2.将含有重组质粒的阳性转化子，接种至含氨苄青霉素100μg／mL 的LB培养基内，37℃振荡培养3h，加IPTG至终浓度0.5 ～1.0 mmol/L,继续振荡培养诱导4～6h， 离心收集菌体进行SDS-PAGE检测,重组子表达相对分子量约为32kD的肺炎链球菌PspA蛋白，表达量约为30%，而对照菌BL21(DE3)无此蛋白带；

表达肺炎链球菌PspA蛋白的纯化:

将诱导表达融合蛋白的工程菌离心收菌，菌体重悬于裂解液内，裂解液为50 mmol/L Tris-HCl pH8.0、10 mmol/L EDTA、10 mmol/L　DTT，超声破菌10 min，离心收集上清，上清溶液加已经平衡的Glutathione Sepharose 4B凝胶3ml,室温结合60min,上样，收集穿透液；用十倍柱床体积的1×PBS洗涤柱子，接着用15ml高浓度的GSH洗脱液（50 mmol/L Tris-HCl pH8.0+10 mmol/L GSH）分三次洗脱目的蛋白,即为纯化的肺炎链球菌PspA蛋白胞外区片段。

3.权利要求1所述的化学合成的肺炎链球菌PspA蛋白胞外区的基因片段序列，利用细菌、酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞及转基因动植物进行重组表达、制备。

4.权利要求2或权利要求3所述的方法制备的肺炎链球菌PspA蛋白胞外区片段，用于肺炎链球菌感染抗体的检测及单抗和多抗的制备。