[发明专利]化学合成的肺炎链球菌PspA蛋白胞外区基因片段及其表达、应用

说明书

技术领域

本发明化学合成的肺炎链球菌PspA蛋白胞外区基因片段及其表达、应用涉及的是一种肺炎链球菌表面蛋白A抗原片段的表达、纯化及应用，通过化学合成肺炎链球菌表面蛋白A(PspA蛋白)全新基因片段，利用基因工程技术，制备重组蛋白。通过计算机分析，筛选出含强抗原表位肺炎链球菌PspA蛋白的片段，选择原核生物偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，利用基因工程技术表达，表达的蛋白可用于肺炎链球菌感染抗体的检测及单克隆抗体的制备等，本发明涉及基因工程技术和检测试剂领域。

背景技术

肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）简称肺炎球菌（pneumococcus）。为革兰染色阳性菌。肺炎链球菌会导致不同种类的疾病，包括有急性鼻窦炎、中耳炎、脑膜炎、骨髓炎、脓毒性关节炎、心内膜炎、腹膜炎、心囊炎、蜂窝组织炎及脑脓肿。

目前针对肺炎链球菌感染的主要检测方法有：细菌学分离法，酶联免疫法(ELISA) ，DNA探针及PCR技术等。但这些方法或多或少都存在着实验时间长，不适合现场快速检测等缺点。近年来，免疫金标层析技术在生物医学各领域得到了广泛的应用，为肺炎链球菌的检测提供了新的思路。筛选肺炎链球菌外膜特异性抗原，并制备高纯度的特异性抗原，是建立该技术的重要前提。

肺炎链球菌表面蛋白A(PspA)是肺炎链球菌重要的毒力因子，在所有临床分离的肺炎链球菌中均发现它的存在。PspA主要有五个域组成：一个信号肽，一个α螺旋区，一个脯氨酸富集区，一个胆碱结合区和一个C端尾巴。研究表明，PspA蛋白在不同血清型菌株中有广泛的同源性，但其α螺旋区存在较大的变异性。

发明内容

本发明目的是通过化学合成的截短的PspA蛋白的全新基因片段，利用基因工程技术，制备PspA蛋白高表达片段。通过计算机分析，筛选出含强抗原表位的PspA蛋白胞外区片段,第33个氨基酸－第109个 氨基酸，共77个氨基酸，选择原核生物偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，利用基因工程技术表达该基因。表达的蛋白可用于肺炎链球菌感染抗体的检测或单克隆细胞株的制备。

化学合成的肺炎链球菌PspA蛋白胞外区基因片段及其表达、应用是采取以下步骤实现的：

1．PspA蛋白抗原表位的筛选及其基因片段的化学合成：

利用ANTHEWIN等软件，通过计算机分析的氨基酸序列，发现PspA蛋白含有较强的抗原决定簇，选择第33个氨基酸－第109个氨基酸作为研究对象。选择原核生物偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，并且在5'端增加了BamHI酶切位点（下划线部分），在3'端增加了终止密码子（TAA）和EcoRI酶切位点（下划线部分），使该基因片段易于克隆至质粒pGEX4T-2内的BamHI和EcoRI酶切位点内。

筛选的PspA蛋白片段氨基酸序列（第33个aa － 第109个aa）：

化学合成的PspA基因片段的DNA 序列（246 bp）：

GGATCC GAA GCC CCG GTT GCC AGC CAA TCG AAG GCG GAA AAA GAC TAC GAC GCA GCC GTG AAG AAA AGC GAA GCA GCG AAA AAA GCA TAC GAA GAA GCA AAA AAG AAA GCG GAA GAT GCC CAG AAG AAA TAC GAT GAA GAC CAA AAG AAA ACC GAA GAA AAA GCG GAA AAC GAA AAG AAA GCG GCG GCA GAC CTG AAT GAA GCG ACC GAA GTC CAT CAA AAG GCG TAT GTG CGT TAC TAA CTCGAG

2．表达PspA蛋白胞外区片段重组质粒的构建:

提取质粒pGEX4T-2,用 Bam HI和EcoR I双酶切，电泳后回收酶切的质粒大片段, 溶于去离子水内。同样用BamHI和EcoR I双酶切化学合成的PspA基因片段，电泳回收后, 溶于去离子水内。