[发明专利]能提高多杀菌素产量的基因工程菌及构建方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种高产多杀菌素的基因工程菌及其构建方法。

背景技术

多杀菌素是由放线菌刺糖多孢菌(Saccharopolysporaspinosa)发酵产生的21碳的大环内酯类化合物，包含两个脱氧糖：3-O-甲基化鼠李糖和福乐糖胺。多杀菌素A和D是在刺糖多胞菌发酵液中两个主要组分。多杀菌素已显示出广谱的杀虫活性，是环境友好且对哺乳动物无药害的生物高效杀虫剂。多杀菌素类绿色杀虫剂因其低风险，无特定靶向物种，环境影响小，对人畜毒性低等特点被授予1999年的总统绿色化学品挑战奖。

多杀菌素合成途径由27个基因编码。五个基因（SpnA，spnB，spnC，spnD和spnE）编码I型聚酮合成酶（PKS）；四个基因（spnF，spnJ，spnL，spnM）转换聚酮合成酶的产物；spnG，spnH，spnI和spnK与鼠李糖的附着和甲基化有关；spnP，spnO，spnN，spnQ，spnR和spnS涉及福乐糖胺的合成；四个基因（ORF-L15，ORF-L16，ORF-R1，ORF-R2）不参与多杀菌素的合成；另外四个与鼠李糖合成有关的基因（gtt，gdh，epi和kre）在基因组的其他区域而不是基因簇中。Madduri等（Madduri K,et al.Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology,2001a,27:399-402）研究发现，刺糖多胞菌在整个发酵期都会积累缺少福乐糖胺的中间体pseudoaglycones（PSA）。通过过表达带有原始启动子的鼠李糖合成基因，可以明显提高多杀菌素的产量[Madduri K,et al.Journal of bacteriology,2001b,183:5632-5638]。Pan等（Pan HX,et al.Biotechnology letters,2011,33:733-739）也通过过表达PermE*启动子控制下的鼠李糖合成基因，使多杀菌素产量提高了3.8倍。Kim等（Kim HJ,White-Phillip JA,Ogasawara Y,et al.Journal of the American Chemical Society,2010,132(9):2901-2903）发现，降低spnH的细胞浓度或者提高spnK的细胞浓度可以增加PSA的产量。但是上述研究忽视了多杀菌素合成途径的不平衡的问题。这种不平衡表现为：（1）spnP，spnO，spnN，spnQ，spnR和spnS这六个基因在多杀菌素生物合成途径中的表达不足；（2）刺糖多胞菌积累非多杀菌素类化合物是因为spnK表达量少，使合成多杀菌素的前体通过其它途径被消耗掉了。因此，通过构建理性的菌株改进策略，调整不平衡的多杀菌素合成途径，从而提高多杀菌素的产量是亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种能提高多杀菌素产量的基因工程菌的构建方法。

本发明的第二个目的是提供一种能提高多杀菌素产量的基因工程菌。

本发明的第三个目的是提供第二种能提高多杀菌素产量的基因工程菌的构建方法。

本发明的第四个目的是提供第二种能提高多杀菌素产量的基因工程菌。

本发明的第五个目的是提供第三种能提高多杀菌素产量的基因工程菌的构建方法。

本发明的第六个目的是提供第三种能提高多杀菌素产量的基因工程菌。

本发明的第七个目的是提供第一种能提高多杀菌素产量的基因工程菌的用途。

本发明的第八个目的是提供第二种能提高多杀菌素产量的基因工程菌的用途。

本发明的第九个目的是提供第三种能提高多杀菌素产量的基因工程菌的用途。

本发明的技术方案概述如下：

一种能提高多杀菌素产量的基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：

①将spnK表达盒插入大肠杆菌-刺糖多孢菌穿梭质粒pOJ260，构建重组质粒pLU101；

②将重组质粒pLU101导入刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）ATCC49460中，重组质粒通过同源重组整合至基因组，得到能提高多杀菌素产量的基因工程菌，命名为LU101；

所述spnK表达盒由ermE*启动子、spnK编码基因和spnK终止子组成；