[发明专利]表达方法

说明书

提高蛋白质在微生物发酵过程中的成品收率。这通过这样一种方法达到，其中在短小芽胞杆菌种微生物中引入包含启动子和编码蛋白质的核酸的表达构建体，蛋白质在所述表达构建体中表达。

本发明属于生物技术领域，尤其微生物蛋白质合成领域。具体地说，本发明涉及一种通过经过基因修饰的微生物生产蛋白质的方法，另外，还涉及能用于这种类型的方法的微生物。本发明还涉及这种类型的微生物在蛋白质生产中的应用。

可以使用微生物来制造有用物质。例如，有用物质是低分子化合物，例如，食品补充材料或制药学上有效的化合物，或蛋白质，由于其多样性而具有广大的技术应用范围。在第一种情况下，利用和/或改变相关微生物的代谢特性来制造有用物质用；在第二种情况下优选使用能表达目的蛋白质的基因的微生物。

为了进行大规模的生物技术生产，在发酵罐中培养微生物，根据其新陈代谢特性配置该发酵罐。在培养期间微生物代谢所提供的底物,并形成所希望的产品，后者在发酵结束之后通常从生产微生物中分离出来，并从发酵罐肉汤和/或发酵培养基中提纯和/或浓缩。在蛋白质的发酵生产中，除碳源(一般为葡萄糖)外，一般使用复杂的富含蛋白质的原料作为底物。因此，蛋白质生产相当于底物蛋白质向目的蛋白质的生物转化。这要求把蛋白质完全水解为各氨基酸，其可供目的蛋白质生物合成使用。

因而在微生物发酵方面有大量现有技术，从优化相关菌株，例如在形成速度和养分利用方面，通过发酵罐的技术设计，直至从相关微生物和/或发酵培养基分离有用物质。

在微生物发酵中采用细菌原则上是期望的。

细菌的特征在于，传代时间短和对培养条件要求低。因此可以建立成本低廉的培养方法或生产方法。本领域技术人员在发酵技术上有丰富的经验。优选采用格兰氏阳性细菌，因为它们将要生产的蛋白质(目的蛋白质)分泌至其周围的培养基中。

通常在微生物发酵时期望获得尽可能高的成品收率(product yield)。例如,国际专利申请WO 91/02792公开了在来自地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)基因调节序列，尤其是地衣芽孢杆菌启动子的控制下,在优化的地衣芽孢杆菌菌株中，经过改善地生产来自迟缓芽胞杆菌(Bacillus lentus)的碱性蛋白酶。

在现有技术中还没有令人满意地可与地衣芽孢杆菌相比，籍此达到高的或者甚至更加改善的成品收率的替代生产微生物可供使用。此外，对于使高成品收率成为可能的微生物发酵方法，还存在一种较高的需求。

本发明的目的在于，在微生物发酵中达到产品，尤其蛋白质的高成品收率。

本发明的提供通过微生物生产蛋白质的方法,包括下列方法步骤：

(a)在微生物中引入包括启动子和编码蛋白质的核酸的表达构建体；

(b)在该微生物中表达蛋白质，其中该微生物属于短小芽胞杆菌(Bacilluspumilus)种。

另外，根据本发明的方法还可选地包括另一方法步骤:

(c)培养该微生物。

因此，在根据本发明优选的实施方案中，根据本发明的方法指的是一种发酵方法。

令人意外地发现，在这种方法中采用短小芽胞杆菌种的细菌使高的成品收率成为可能，并因此是有利的。通过采用短小芽胞杆菌作为生产生物可以达到有利的，尤其是提高的成品收率。在这方面,用地衣芽孢杆菌作为参考，这是在现有技术中确立的在大量微生物发酵中工业采用的生产微生物。

因此，在优选的实施方案中，根据本发明的方法提高蛋白质在微生物中表达的方法。如果根据本发明的方法与可比较的方法相比获得数量较大的蛋白质时，则提高了蛋白质表达，该可比较的方法与根据本发明的方法的差异只在于它采用地衣芽孢杆菌种细菌，优选野生型。待比较的两方法，在这方面都在相同的、尽可能最优的微生物条件下和相同的持续时间进行。