[发明专利]核酸内切酶

说明书

技术领域

本发明涉及特别显示不耐热特性的、通过温和处理条件失活的核酸内切酶。本发明还包含通过使用此类核酸内切酶从生物制剂中去除污染多核苷酸。本发明还涉及通过使用核酸内切酶阻止核酸扩增反应、特别是涉及聚合酶链反应(PCR)设置的扩增反应中的假阳性结果。

背景技术

核酸且尤其是基因组DNA，通常在细胞培养、细胞裂解产物以及蛋白质纯化和分析中造成问题，因为它在样品中产生粘度或干扰纯化、下游分析或应用。DNA和核酸的去除可在物理上、化学上或酶促完成。DNA和RNA的酶促去除可通过添加核酸酶来实现。然而，核酸酶通常未能降解复杂生物样品中的DNA，因为DNA与蛋白质或其他分子结合，从而保护其不受酶促降解。氯化钠通常加入典型细胞裂解缓冲液中，以限制蛋白质-DNA相互作用，并且因此促进下游蛋白质纯化中的DNA去除。不幸的是，大多数核酸酶在适度盐浓度下变得高度受抑或失活，从而通常使得酶促去除无效。因此，从蛋白质、试剂或生物样品中去除所有痕量DNA通常是麻烦的。

存在在细胞裂解产物、蛋白质纯化中和分析步骤前酶促去除核酸的几种商业替代方案，例如Benzonase(粘质沙雷菌(Serratia marcescens)核酸酶)、Omnicleave(Epicentre)或DNA酶I。然而，不存在可通过适度热处理失活的选项。为了在使用后去除上述酶，通常需要多种树脂、抑制剂或柱纯化步骤。这使得酶促方法更难以使用，因为需要另外的试剂或纯化步骤以在使用后去除核酸酶。这是更耗时的并且可导致目的蛋白质的更低得率。

在蛋白质纯化中或从试剂中去除痕量DNA的问题在商业聚合酶和主要混合物中通常发现的内源DNA中是显而易见的。此外，用于分子生物学应用(例如PCR和测序)和分子诊断学的试剂必须不含污染DNA和核酸酶两者。与在使用后去除上述核酸酶相关的困难使得它们较不适合于清除用于DNA技术的试剂。

核酸扩增技术例如PCR是生物技术中可获得的最有力工具之一，允许由仅含少量核酸的样品制备大量靶序列拷贝。在PCR的情况下，将与其双链靶序列的各自链互补的寡核苷酸引物加入含有靶序列和游离核苷酸的反应混合物中。在DNA聚合酶的存在下的热循环导致在引物之间的序列扩增。由PCR过程产生的扩增片段充当后续PCR循环的模板的能力导致相当大数量的靶序列的快速产生。

对核酸污染的有害效应特别敏感的扩增反应是定量PCR(qPCR)技术，因为这些具有定量反应中的少于20个DNA序列拷贝的能力。因此，即使最小水平的核酸污染也在qPCR技术中给出假结果。另外，这些方法需要检测超过不可避免的本底信号的来自扩增的靶核酸的信号。污染核酸可促成该本底信号，并且因此降低技术的灵敏度。像这样，使污染核酸降到最低使定量PCR实验的灵敏度达到最大。在其中检测小数目的靶核酸拷贝的实验中，例如基于定量PCR的病原体诊断和病原体负荷定量，最重要的是定量PCR的灵敏度达到最大并且假阳性降到最低。在其中通过qPCR技术靶向高度保守的细菌DNA区段(例如16SrRNA或23SrRNA基因)的细菌鉴定和诊断领域中，起于DNA聚合酶制剂的核酸污染(其通常得自细菌和细菌表达系统)是主要问题。因此需要有效去除来自DNA聚合酶制剂的细菌核酸污染物的方法。尤其寻求的是可实现这点而对下游扩增反应没有有害影响并且不损害聚合酶的方法。

已提出个别PCR反应混合物可在添加靶DNA和Taq DNA聚合酶前使用核酸内切酶进行处理，所述核酸内切酶对靶序列内部切割，因此阻止污染DNA的扩增(Furrer等人Nature.第346卷，第324页，1990)。该方法要求30分钟的去污时间，并且为了使去污后的核酸内切酶失活，将反应混合物煮沸。由于该煮沸步骤，需要在去污后加入DNA聚合酶。当然，这代表将携带污染引入扩增前混合物内的进一步危险，并且妨碍DNA聚合酶自身的去污。

特异性破坏DNA的不耐热的核酸内切酶(DNA酶)已得到描述。WO 99/007887公开了从北极甜虾(Pandalus borealis)中分离的DNA酶，所述DNA酶在94℃下2分钟后基本上不可逆地失活。该相同酶还在65℃下15分钟后基本上不可逆地失活。然而，这些温度对于某些应用太高，并且另外希望去除污染RNA和单链DNA(ssDNA)。