[发明专利]用于传染性皮下及造血器官坏死病毒的实时病毒检测方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于检测虾(shrimps)中由传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)引起的病毒感染的方法。更具体地，本发明提供一种高通量实时病毒性检测方法，用于筛选和鉴定虾中IHHNV，以及一种快速检测系统及其试剂盒。这能够控制虾中IHHNV的流行，从而增强虾类养殖业中的育种计划，特别是对于巨型淡水虾——罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)。

背景技术

巨型淡水虾——罗氏沼虾，是世界各地最常用的商业养殖虾种。作为富含蛋白质的好食物来源，这种虾被称为高价值的水产养殖产品之一。此外，作为一种有价值的出口产品，它具有重要商业价值。然而，虾养殖中的管理不善常引起广泛的病毒感染，这也已成为罗氏沼虾虾养殖计划的主要限制因素。在更严重的程度上，病毒感染导致急性流行病，频繁地伴随虾种群的爆发性死亡，导致商业水产业实际经济损失，并对有价值的野生种群延续造成威胁。

IHHNV感染是虾病害的主要原因之一，尤其在罗氏沼虾中，它已被世界动物卫生组织(OIE)列为最显著的水产业病害之一。IHHNV感染也出现在马来西亚的淡水虾——罗氏沼虾中，并在2009年有所报道。最初通过常规的聚合酶链反应(PCR)并使用标准的OIE列出的引物扩增病毒基因组内389bp的特异性区域来检测这种感染(OIE,2003)。然而，这种建议的引物的使用伴随着现有的实验程序显示出在PCR结果中的非特异性条带。这可能是由发生在IHHNV病毒基因组中的突变引起的，或由样品中病毒载量水平低引起的。因此，罗氏沼虾虾养殖中的一个主要目标集中于更特异性引物和更有效方法的研究和开发，以获得对IHHNV的更精确和可靠的检测结果。

现有技术中有几个专利技术涉及用于检测IHHNV的方法、系统或试剂盒。在这些现有技术，美国专利第2008293037号披露了用于诊断检测IHHNV的引物序列。根据该文献，分离的引物基于IHHNV基因组的一个新的部分，并且可以在引物引导的扩增(primer-directed amplification)或核酸杂交测定法中使用。这种方法意在检测IHHNV的存在并定量化该病毒。然而，该专利技术仅使用简单的扩增和杂交方法，并没有公开任何与其预定程序配套的特异性PCR引物以提供快速且特异性的检测结果。

现有技术中也公开了PCR扩增检测IHHNV或有关虾病毒的其它例子。马来西亚专利申请号PI2011002235公开了一种通过巢式PCR技术检测生物样品中IHHNV的方法。此方法包括使用第一引物组通过第一PCR扩增生物样品中病毒的保守片段的步骤；以及在第二PCR中使扩增的保守片段与第二引物组接触的步骤。然而，这种巢式PCR方法对于检测发展阶段的IHHNV的存在可能并不足够敏感。

此外，中国专利第1786711号也提供了一种用于检测IHHNV的荧光定量(FQ)-PCT方法和试剂盒，提供正向引物和反向引物以及荧光探针。这种荧光探针使用罗丹明(TAM)作为荧光基团、四甲基罗丹明(TAMRA)作为猝灭剂。然而，该文献没有披露所应用的IHHNV引物的来源。该文献也没有披露这种方法和试剂盒的效率，以及是否不同种的IHHNV可以在其不同发展阶段进行定量检测。

IHHNV是20至22nm、二十面体、无包膜病毒，在CsCl中的密度为1.40g·ml^-1，并含有单链线性DNA基因组。这种病毒能引起严重的生长迟延，在商业淡水虾养殖生产中导致严重阻碍。它可以持续存在于健康携带者中，并通过垂直传播传递给其子代，以及通过水平传播传递给其它种群。由于野生或池塘养殖的种系可能是无症状个体，它们不可避免地在虾养殖中造成生物安全风险。因此，需要开发对病毒病原体的健康携带者进行IHHNV检测的方法。此外，对感染的对虾中病毒载量的定量允许养殖虾病的监控，因此可以在疾病爆发前采取有效措施。

现有技术显示，现有的基于PCR的IHHNV检测不能给出特异性且可靠的结果，以用于灵敏且准确地检测罗氏沼虾中的IHHNV，特别是在其各种发展阶段。此外，大多数现有技术中可用的检测方法和系统集中于受感染的虾而不是健康携带者。因此，本发明期望提供一种特别设计的方法、系统或试剂盒，用于实时定量检测IHHNV，以克服现有技术的缺点。

发明内容

本发明的首要目的在于，提供一种用于虾样品尤其是罗氏沼虾中的实时定量检测IHHNV的方法。

本发明的另一个目的在于，提供一种诊断试剂盒，用于IHHNV的快速检测，其基于专门设计的实时聚合酶链式反应(PCR)技术。