[发明专利]柱上酶切割

说明书

本发明属于使用固定化金属离子亲和层析联合通过柱上切割酶移除金属离子亲和层析标签的多肽纯化和多肽生产领域。因此，本文报道了使用蛋白酶柱上切割包含金属离子亲和层析标签的多肽的方法。

发明背景

蛋白在现今的医用组合中发挥重要的作用。用于生产重组多肽的表达系统在本领域中是公知的。用于药物应用的多肽主要在原核细胞，比如大肠杆菌中，和哺乳动物细胞比如CHO细胞，NS0细胞，Sp2/0细胞，COS细胞，HEK细胞，BHK细胞，细胞等中生产。

对于人类应用，每种药用物质必须满足不同的标准。为了保证生物药剂对人的安全性，例如，会引起严重危害的核酸，病毒，和宿主细胞蛋白必须被移除。为了满足质量管理规格标准(regulatory specification)，一个或更多个纯化步骤必须遵循制造工艺。其中，纯度，通量，和产量在决定合适的纯化工艺方面发挥重要作用。

不同方法已得到确认并且广泛用于蛋白纯化，比如用微生物蛋白亲和层析(例如蛋白A或蛋白G亲和层析)，离子交换层析(例如阳离子交换(磺丙基或羧甲基树脂)，阴离子交换(氨乙基树脂)和混合模式离子交换，嗜硫吸附(例如用硫醚配体)，疏水相互作用或芳香吸附层析(例如用苯基-琼脂糖，杂氮-arenophilic树脂，或m-氨基苯硼酸)，金属离子螯合亲和层析(例如用Ni(II)-和Cu(II)-亲和材料)，尺寸排阻层析，和电泳方法(比如凝胶电泳，毛细管电泳)(参见例如Vijayalakshmi，M.A.，Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93-102)。

发明概述

已经发现，可以使用基于固定化金属离子亲和层析(IMAC)的方法纯化和酶切割包含离子亲和层析标签(亲和标签)和蛋白酶切割位点的多肽原。更准确地来说，已经发现必须将结合于IMAC柱的多肽原与包含尿素的溶液接触(例如清洗)至少一次，以允许之后的工艺步骤进行，即，以使得之后的大规模下游(例如纯化)工艺步骤能够进行的浓度和纯度回收切下的多肽。

如本文报道的一个方面是从在其N-或C-末端包含金属离子亲和层析标签和介于所述标签和所述多肽之间的蛋白酶切割位点的多肽原，通过在固定化金属离子亲和层析柱上进行柱上酶切割所述蛋白酶切割位点生产多肽的方法，所述方法包括以下步骤(以一下步骤)：

-变性结合于金属离子层析材料的多肽原，

-复性结合于金属离子层析材料的多肽原，和

-将结合的多肽原与蛋白酶孵育，从而生产所述多肽。

在一个实施方案中，所述变性是通过将结合的多肽原与包含变性剂的溶液相接触。在一个实施方案中，所述复性多肽原是通过将变性的多肽原与无变性剂的溶液相接触。

如本文报道的一个方面是从在其N-或C-末端包含金属离子亲和层析标签和介于所述标签和所述多肽之间的蛋白酶切割位点的多肽原，通过在固定化金属离子亲和层析柱上进行柱上酶切割所述蛋白酶切割位点生产多肽的方法，所述方法包括以下步骤：

-将结合的多肽原与包含变性剂的溶液相接触，

-任选地，如果用于之前步骤的包含变性剂的溶液无尿素或尿素衍生物，则将结合的多肽原与包含尿素或尿素衍生物的溶液相接触，或如果用于之前步骤的包含变性剂的溶液包含尿素或尿素衍生物和变性剂的混合物，则将结合的多肽原与包含尿素或尿素衍生物的溶液相接触，

-通过将结合的多肽原与蛋白酶孵育从固定化金属离子亲和层析柱回收所述多肽并从而生产多肽。

在一个实施方案中，所述方法包括在与蛋白酶孵育前直接用无变性剂溶液的清洗步骤。

在一个实施方案中，所述金属离子亲和层析标签在多肽的N-末端。

在一个实施方案中，在回收步骤前复性所述多肽。在一个实施方案中，以天然形式回收所述多肽。

在一个实施方案中，以变性形式回收所述多肽。

在一个实施方案中，所述尿素或尿素衍生物具有从约0.5M至约8M的浓度。在一个实施方案中，所述尿素或尿素衍生物具有从约2M至8M的浓度。在一个实施方案中，所述尿素或尿素衍生物具有约4M的浓度。

在一个实施方案中，所述变性剂选自盐酸胍，尿素，硫脲，和四甲基脲。在一个实施方案中，所述变性剂是盐酸胍。

在一个实施方案中，所述变性剂具有从约0.5M至约6M的浓度。在一个实施方案中，所述变性剂具有从约1.5M至约3M的浓度。在一个实施方案中，所述变性剂具有约2M的浓度。