[发明专利]使用可裂解探针复合检测慢性粒细胞性白血病基因的方法

说明书

技术领域

本发明涉及慢性粒细胞性白血病基因诊断试剂盒和使用该试剂盒的诊断方法。更具体地，本发明涉及通过使用引物组和可裂解探针使得能够实时地检测基因的试剂盒，以及使用该试剂盒的诊断方法。

背景技术

白血病泛指其中白细胞瘤性(neoplastically)增殖的所有疾病。根据白细胞起源的白细胞，白血病被分为“粒细胞性白血病(髓细胞性白血病，myelogenous leukemia)”和“淋巴性白血病(淋巴细胞性白血病，lymphatic leukemia)”，或根据进展速度，白血病被分为急性白血病和慢性白血病。根据疾病的类型和所侵袭的细胞的特征，白血病的临床类型(临床证型，clinical pattern)不同。淋巴性白血病是由淋巴性血细胞的突变引起的，粒细胞性白血病是由粒细胞性(骨髓性，myelogenous)血细胞的突变引起的，而慢性粒细胞性白血病(CML)是由成熟细胞的突变引起的，换言之，由多能造血干细胞的恶性克隆引起的。急性粒细胞性白血病是由成髓性干细胞(myeloblastic stem cell)从血细胞生成的早期阶段开始分化的缺陷引起的。

在这些不同类型的白血病中，CML是其中成髓性细胞(原始粒细胞，myeloblast cell)在骨髓中增殖并侵袭外周血或其他器官的恶性血恶液质(hematodyscrasia)，并且CML在成人中的发病率很高。诊断CML最重要的事情是通过进行染色体检验来检测费城染色体，其获得在95％或更多的患者中的阳性结果。

已经查明CML的多种病因，但CML的最常见病因是染色体易位。特别是，已知9号染色体和22号染色体的易位为CML的主要病因。实践中，在约95％的CML患者中发现了9号染色体和22号染色体的相互(reciprocal)易位。该相互易位由位于9号染色体的q34区域的abl(Abelson癌基因)基因的一部分转移至位于22号染色体的q11.2区域的bcr(断裂点簇区，breakpoint cluster region)基因形成的。此重排被称为BCR-ABL重排。对于由BCR-ABL重排引起的CML，以Glivec^TM的商品名市售的药物甲磺酸伊马替尼(imatinibmesylate)具有优异的治疗效果。因此，BCR-ABL重排的早期诊断在患者治疗方案的决定和预后中非常重要。

为检测BCR-ABL重排，通常使用使BCR-ABL融合基因的重组程度量化的方法。目前开展了大量研究以开发以更方便的方式使BCR-ABL融合基因的重组程度量化的方法。例如，开发了使用FISH(荧光原位杂交法)的诊断方法(Tkachuk et al.,Science,250(4980):559-562,1990)、使用体细胞DNA的PCR的方法(Dobrovic et al.,Blood,72(6):2063-2065,1998)、使用RT-PRC的方法(Lee et al.,Blood,73(8):2165-2170,1989)以及使用巢式PCR(nested PCR)的方法(Hessner et al.,Genet.Anal.Tech.Appl.,11(4):90-94,1994)。

然而，以上列出的方法中，基于FISH的方法是用于直接检测其中已经发生BCR-ABL重排的单个细胞，并且因此，基于FISH的方法不允许早期检测CML。RT-PCR方法具有较高的灵敏度，但需要细胞遗传学方法，因为它通常难以设计出允许诊断患有非常罕见的CML患者的引物组。出于上述原因，在疑似患有CML的患者的情况下，在诊断的早期进行多种细胞遗传学方法。然而，细胞遗传学方法包括许多限制：只有在骨髓白细胞的细胞周期到达“中期(metaphase)”时才能进行细胞遗传学方法，需要满足各种条件如增殖细胞的提取和培养，并且需要足够的增殖细胞数量等。此外，常规的RT-PCR法是复杂的，因为根据BCR-ABL基因的类型应当进行独立的反应用于分析BCR-ABL基因。因此，通过改进传统的方法，已经研究了在诊断CML中可能是更加有用的检测方法。其结果是，开发了根据本发明的使用可裂解探针的检测试剂盒和使用其的诊断方法。

发明内容

技术问题

本发明的一个实施方式提供了用于检测BCR-ABL融合基因断裂点的试剂盒，其中，该试剂盒包含引物组和可裂解探针，其使得能够特异性地扩增BCR-ABL融合基因断裂点。