[发明专利]在单个样品上的免疫荧光和基于荧光的核酸分析

说明书

发明领域

本发明涉及在生物样品上对蛋白表达和靶核酸序列的检测。更具体地讲，本发明涉及能够在生物样品的同一切片上进行蛋白表达和靶核酸序列的荧光检测的方法。还提供的是用于进行所述新方法的试剂盒和系统。

发明背景

大部分疾病具有不同类型的表型，并且需要复杂的表征，用于患者评价。例如，乳腺癌由5种不同亚型组成，每种亚型都涉及不同表型、生存时间和治疗反应性。例如，管腔型(luminal type)具有最好的预后并对激素治疗有良好反应，而HER2-阳性和基底肿瘤的患者却发展不良。尽管目前靶向疗法的发展已经显著地影响了HER2-阳性肿瘤的治疗，但是这些患者中的许多都不反应，或发展出抗性。在这些案例中的许多案例中，已经鉴定了HER2基因中的突变或其它途径(例如PI3K/AKT)的活化，并且已经提出了同时靶向正常的和突变的HER2的新的疗法或者还影响其它途径的组合疗法。另外，若干研究甚至已经指出，在不同乳癌亚型中的相同基因的变化可能差异地影响疾病进程和治疗反应两者。因此，对患者肿瘤的综合分析(comprehensive profiling)对于医生能够为该患者做出最佳治疗决策而言是至关重要的。

在一部分乳腺癌患者中，扩增HER2基因作为恶性转化和肿瘤发展过程的部分。HER2基因扩增通常导致乳腺癌细胞表面上的HER2蛋白过量表达。在25-30%的乳腺癌中已经证明了HER2基因的扩增和/或其蛋白的过量表达。若干研究已经证明HER2状态与对某些化学治疗方案的敏感性或抗性有关。高HER2蛋白过量表达或HER2基因扩增的表现对于启动用Herceptin (针对HER2蛋白的一种单克隆抗体)的疗法是必不可少的。临床研究已经证明，具有高HER2蛋白过量表达和/或HER2基因扩增的肿瘤的患者从HerceptinHER2蛋白水平和HER2基因扩增。然而，两种患者样品常规用于进行IHC和FISH分析，可能导致两种结果之间缺少一致性。理想的是，在同一样品上和在细胞-细胞水平上同时进行这两种分析。

在胃或胃-食管结合处的晚期或转移癌的患者中，大约20%具有HER2-阳性疾病。与未分化的癌症和混合肿瘤相比，腺癌更常见为HER2-阳性；与胃肿瘤相比，胃-食管结合处癌症更有可能为HER2-阳性。已经证明曲妥单抗?改善了HER2-阳性的胃或胃-食管结合处的晚期或转移性癌症患者的生存率。研究表明基因扩增(FISH)和蛋白过量表达(使用免疫荧光检测)与乳腺癌的关联不一样，因此不应该用单一方法来确定HER-2状态。

尽管多种方法可用于生物学和医学，以观察生物样品中的不同靶标，但是许多现有技术在单个样品中在同一时间内仅可检测少量靶标(例如免疫荧光(IF)，其中可检测的靶标数量受限于基于荧光的检测系统)。对靶标的进一步分析可能需要使用来自来源的额外的生物样品，限制了测定靶标的相对特性(例如生物样品中的多个生物靶标的存在、不存在、浓度和/或空间分布)的能力。此外，在某些情况下，可以得到有限量的样品用于分析或者可能需要单个样品用于进一步分析其它目标蛋白，例如细胞周期或其它癌症生物标记。因此，需要能够反复分析单个样品的方法、试剂和装置。

若干实验室已经试图在单个样品上组合蛋白表达和基于DNA的分析。Lottner等人描述了一个方案，其在单个组织样品上先进行FISH，再进行HER2的IF，接着进行图像分析。J Pathol. 2005；205(5):577-84；doi: 10.1002/path.1742。作者注意到，在FISH之前进行IF导致较高的荧光背景和较弱的免疫荧光。Reisenbichler等人在单个样品上对于HER2进行了免疫组织化学(IHC)和显色原位杂交(CISH)组合的实验。Am J Clin Pathol 2012；137:102-110；doi: 10.1309/AJCPLNHINN9O6YSF。尽管作者通过先使CISH样品成像、再使IHC样品成像而能够得到信号，但他们发现当不仅是在CISH之后进行IHC，而且直到所有湿实验室(wet lab)实验完成才使样品成像(即没有中间成像步骤)时，获得更好的图像。重要的是，当Reisenbichler等人在样品上先进行IHC，再进行CISH时，他们不能获得CISH信号。