[发明专利]戊糖发酵微生物

说明书

技术领域

木糖是植物生物质的主要基础材料，并与现今生物精炼观点聚焦的大量主要原料紧密相关。这类富含木糖的材料的实例包括麦秸、玉米秸秆或木片或其它木材副产品(Blake A Simmons等人.Genome Biol.2008；9(12):242)。

因此，通过酶促、化学或化学/酶促方法进行的起始材料的水解产生了其他有价值的糖之外的富含木糖的中间产物(Deepak Kumar等人.Biotechnol Biofuels.2011；4:27)。在耦合发酵路线中对富含C5的糖溶液的高效利用对于应用的发酵菌株既是至关重要的，也是必需的(Sara Fernandes and Patrick Murray,Bioeng Bugs.2010；1(6):424)。特别地，C6酵母(如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))由于较长历史的培育(最终以极端耐乙醇和葡萄糖转化高产量为特点)而成为理想的工作平台，使得木糖完全不受影响，从而降低了潜在产量。已知的几种策略可以避免这种缺陷。此处的关键步骤似乎为通过将木糖异构化为木酮糖以及随后的C5非还原部分分流到酿酒酵母的常规糖酵解途径的修饰级联而成功地供料木糖。虽然对通过特定转运蛋白的跨膜摄取木糖的强度和通过C5旁路可达到的通量密度进行了可能的改进(David Runquist等人Microb Cell Fact.2009；8:49)，但是木糖到木酮糖的关键异构化步骤在整个过程中成为主要问题。为进行该步骤已知有两种主要途径。第一，采用还原成木糖醇(通过木糖还原酶)和氧化(通过木糖醇脱氢酶)成木酮糖的后续步骤，导致NADH和NADPH辅因子之间的极大不平衡，并导致木糖醇在发酵条件下的形成增加(Maurizio Bettiga等人.Biotechnol Biofuels.2008；1:16)。应用木糖异构酶的备选的直接异构化途径问题在于如下的木糖异构酶基因的可得性不足，其兼具有在真核微生物(特别是酵母，例如酿酒酵母)中的活性表达、高催化效率、与发酵温度相适的温度和最适pH以及副产物尤其是木糖醇的低抑制。本发明的一个方面是满足此需求的蛋白质序列及编码其的核酸的公开内容。

木糖异构酶途径对于细菌物种和极少的酵母是原生的。相较于氧化还原酶途径，异构酶途径不需要辅因子。异构酶途径最少由单一的酶——异源木糖异构酶(XI)组成，其直接将木糖转化为木酮糖。就氧化还原酶途径而言，通过共表达异源木酮糖激酶(XK)可以获得产率的进一步提高。

首次功能性表达的XI是来源于厌氧真菌Piromyces物种E2(Kuyper M.等人FEMS Yeast Res.2003；4(1):69)的xylA基因。构建了在厌氧条件下能发酵作为唯一碳源的木糖的单倍体酵母菌株。大部分木糖异构酶是细菌蛋白并且主要障碍是其在酵母中的表达。然而近期的研究已经证实酵母中的功能性表达(表1)。由于木糖异构酶活性在C5发酵生物体理念中的关键重要性，希望使用最佳的木糖异构酶。就这方面而言，从先前的报道我们得知Clostridium phytofermentans木糖异构酶提供了较低但却是可得的最高的技术标准。因此非常期待在本发明范围内改进木糖异构酶的有益特性。

表1：所主张的应用于酵母中的木糖异构酶实例