[发明专利]细胞死亡测定

说明书

本发明涉及一种使用发光化合物的检测细胞死亡的方法；涉及特定应用的发光化合物；涉及包括所述化合物和蛋白质的检定试剂盒。该方法可用于检测细胞死亡，基本上不论造成细胞死亡发生或正在发生的机理，因此不限于例如检测选自细胞凋亡或细胞坏死中的仅一种机理造成的细胞死亡。

技术领域

本发明涉及的技术领域是细胞死亡探针，检测细胞死亡的方法，检测细胞死亡的化合物和检定检定试剂盒。

背景技术

过多细胞的死亡是血管疾病、神经变性疾病、骨髓异常增生综合征、缺血/再灌注损伤和器官移植排斥等很多疾病的特征。细胞死亡也在疾病的治疗中起作用。在癌症治疗中，例如，多数化疗、放射疗法和抗激素试剂通过引起癌细胞死亡的方式来发挥作用。

细胞死亡在发育和正常的组织或细胞的新陈代谢中起重要作用，例如皮肤、内脏、头发和生殖及免疫系统。在正常的生理条件下细胞死亡是受到严格调控的，其失衡通常与疾病相关，例如中风或心肌梗死之后发生的缺血再灌注损伤、神经变性疾病、骨髓异常增生疾病、器官或细胞移植后发生的排斥、血管疾病和牛皮癣。细胞死亡，主要是细胞坏死，还可以在外伤或完全(部分)缺氧后发生。细胞死亡还在疾病的治疗中起到作用。在癌症中，例如，多数化疗、放射治疗和抗激素试剂引起癌细胞的死亡来发挥作用。

因为细胞死亡在许多疾病中起到这样重要的作用，非常需要对该过程的非侵入式成像，并且需要例如疾病的早期检测和进展的诊断工具以及跟踪疾病的治疗效果。这将不仅仅可以确定例如心肌梗死或中风后组织损伤程度和识别动脉粥样硬化中的易损伤斑块，还可以例如监控癌症的治疗相互作用。

检测细胞死亡的方法在现有技术中是已知的。

标记的膜联蛋白V是广泛用于细胞死亡(特别是凋亡)检测的成像剂。膜联蛋白V是内源性人体蛋白质，其与磷脂酰丝氨酸(PS)的结合具有高的亲和性。在凋亡过程中的PS被认为是通过翻转机理出现在质膜外部，使得它们被巨噬细胞识别，这将吞噬并移除凋亡的细胞。

膜联蛋白V已经被广泛的用于使用荧光标记物的离体细胞的分析。膜联蛋白V还已知的在不同应用中用于临床试验的评估，例如监测中风、心肌梗塞、类风湿性关节炎、阿尔兹海默氏症和化疗及放疗后的肿瘤的死细胞引起的死亡。在多数研究中膜联蛋白用99^mTc(锝)放射性标记。早期研究中的标记过程因为标记效率低而繁琐。除此以外，锝标记的膜联蛋白-V在肾脏、肝脏和膀胱(尿液)中的非特异性吸收很高，并且还会被胆汁排泄到肠道中，使得腹部的成像无法进行。

锝标记的膜联蛋白-V的主要问题是它的尺寸大，使得将其传输到感兴趣位点的速度慢，非目标组织的非特异性吸收和不利的体内分布。另外，放射性标记探针的低的清除率造成示踪剂在体内的停留时间延长，这将导致患者处于高有效剂量的辐射中。除了这些问题之外，还应注意膜联蛋白V对正在死亡的细胞的特异性。这是因为PS也在内皮细胞、巨噬细胞、活性血小板和红细胞外翻。PS外翻不一定代表细胞走向细胞死亡之路。已经知道PS还可以可逆的外翻，这与凋亡细胞无关，特别是在生理应激相互作用的情况下。在缺血再灌注损伤中，相对高的膜联蛋白V吸收是最可能造成大量的应激细胞死亡的，并且不仅仅是一些具有高PS的真的凋亡细胞正在死亡。

其他在离体分析中普遍用于识别凋亡细胞的技术包括：监控半胱氨酸蛋白酶的活性；监控线粒体中的分子，其为细胞凋亡的指示剂，例如细胞色素C；识别磷脂膜的对称性缺失和；识别DNA片段。关于这些技术的详细的讨论和它们的缺陷被记载于“Apoptosis：AReview of Programmed Cell Death”，S.Elmore，Toxicologic Pathology，2007，35，495-516。

现有技术中一些可以检测细胞死亡的方法适合于检测细胞死亡本身；如以上情况的例子，它们是特异性检测细胞凋亡，通常通过检测细胞在凋亡过程中的一些瞬间状态或中间化合物。区分细胞凋亡和细胞死亡本身是很重要的。细胞凋亡涉及程序化的细胞死亡，其包括了从基因上确定细胞的消除；检测细胞死亡本身的机理是相互独立的，并且涉及检测任何细胞死亡机理造成的死亡细胞。