[发明专利]在用于蛋白质表达的细胞系中减少酰胺化的氨基酸形成

说明书

技术领域

本发明涉及一种在细胞系的蛋白质表达过程中减少酰胺化的氨基酸的形成的方法、细胞系及相关应用。

背景技术

虽然蛋白质主要是以其氨基酸序列(原始结构)来表征，但是，在其他方面，像众多的翻译后修饰等也对蛋白质的特征产生影响，如影响蛋白质的二级、三级或四级结构等。其中的一些翻译后修饰对新产生的蛋白的活性具有重要的影响，包括对生物制药生产的药物的安全性和功效产生影响等。

一种对蛋白质的异质性具有重要影响的因素是包括酸性变种在内的电荷模式(charge pattern)。这种电荷模式的形成的方式可以是，例如，像天冬酰胺等氨基酸的脱酰胺，糖基化或者通过N-末端谷氨酰胺形成焦谷氨酸，以及一些基本的变种，例如，酰胺化的氨基酸，特别是C-末端脯氨酸酰胺残基等。

酰胺化的氨基酸的形成，如C-末端脯氨酸酰胺，却是在某些情况下不愿看到，例如，当形成的酰胺化的氨基酸作为一种不受欢迎的异质性来源，或者氨基酸变异可能导致蛋白质的活性或免疫原性受影响，或者酰胺化的氨基酸的含量，例如脯氨酸酰胺的含量，在产生的蛋白质中比在参考蛋白中更高或更低。

相比较能够在高度可控的物理化学条件下产生的小分子药物，蛋白质尤其是作为生物治疗性质(生物制药)的蛋白质，因生产过程中使用的是活细胞培养系统，从而整个生产过程是高度复杂且难以控制的。因此，发展一种简便的、能够用于特别控制产生的蛋白质的翻译后修饰的工具箱是尤为重要的。通过该工具箱可以得到一种具有恒定的产品质量和恒定的高产量的蛋白质产品，并可以提高生产过程的效率，增加和/或微调生产的蛋白的生理活性及衍生出的药物的生物安全性，和/或使生产出的蛋白质的翻译后修饰的特性与参考蛋白匹配。

本发明的目的正是提供系统和方法以解决上述问题及需求。

本发明的独立权利要求记载的系统和方法能够解决上述问题及需求。从属权利要求则记载了优选的实施方案。可以理解，通过数值限定的数值范围是包括有端点数值的。

发明内容

在对本发明作详细介绍之前，本领域技术人员可以理解，本发明不仅仅限于文中特定部分所描述的器件或工具，或者方法部分所描述的方法流程，这些器件或工具及方法可以做若干变形。同样可以理解，文中的用词只是用于描述特定的实施例而已，并不用于限制本发明。此外，对于通过数值来限定的参数范围是包括数值端点值的。

根据本发明的第一方面，本发明提供了一种具有降低的肽酰胺化活性的用于蛋白质表达的细胞。

如本文中所述的，术语“细胞”同样包括由该细胞产生的细胞系。进一步，由该细胞或细胞系产生的动物以及基于细胞的表达平台同样属于本发明的保护范围之内。

如本文中所述的，术语“用于蛋白表达”一词是指根据本发明的细胞，其适于工业生产过程中的蛋白质表达，包括同源和/或异源的蛋白质表达。事实上，根据本发明的细胞适于工业生产的过程意味着，处于自然环境中的该细胞能够根据自身特性降低肽酰胺化活性，但是，正因为如此，并没有进行进一步修饰、隔离或处理，不适合工业生产过程的蛋白质表达，如果存在没有经过进一步修饰、隔离或处理的细胞，并且不适合工业生产过程的蛋白质表达，不会影响根据本发明的细胞的新颖性。

肽酰胺化是一种普遍存在的，往往是多种生物活性肽的翻译后修饰所必经的过程。肽酰胺化在诸如催化神经内分泌肽以激活α酰胺化产品的过程中发挥作用。

然而，在一些情况下，肽酰胺化却是不希望看到的，例如，当形成的酰胺化的氨基酸作为一种不受欢迎的异质性来源，或者氨基酸变异可能导致蛋白质的活性或免疫原性受影响，或者酰胺化的氨基酸的含量，例如脯氨酸酰胺的含量，在产生的蛋白质中比在参考蛋白中更高或更低。

在本发明细胞的一个优选的实施例中，降低的肽酰胺化活性是通过如下方法实现的：

a)抑制或降低编码用于催化肽α－酰胺化的酶的基因的基因表达；

b)表达功能异常或失活的用于催化肽α－酰胺化的酶，或者表达具有降低活性的用于催化肽酰胺化的酶；和/或

c)抑制或降低用于催化肽α－酰胺化的酶的活性。

根据本发明的另一方面，本发明还提供一种在给定细胞中降低肽酰胺化活性的方法，其包括如下步骤中的至少一步骤：

a)抑制或降低编码用于催化肽α－酰胺化的酶的基因的基因表达；

b)表达功能异常或失活的用于催化肽α－酰胺化的酶，或者表达具有降低活性的用于催化肽酰胺化的酶；和/或

c)抑制或降低用于催化肽α－酰胺化的酶的活性。