[发明专利]一种2;4-二羟基丁酸的生产方法

权利要求书

1.一种制备2,4-二羟基丁酸(2,4-DHB)的方法，其包括以下连续步骤：

a)第一步将乙醛酸转化为苹果酰-辅酶A，

b)第二步将之前获得的苹果酰-辅酶A转化为苹果酸-4-半醛，

c)第三步用DHB脱氢酶将苹果酸-4-半醛转化为2,4-DHB；

其中步骤a)经酶催化，该酶具有苹果酰-辅酶A裂解酶活性；

其中步骤b)经具有苹果酰-辅酶A还原酶活性的酶催化，所述具有苹果酰-辅酶A还原酶活性的酶选自具有苹果酰-辅酶A还原酶、琥珀酰-辅酶A还原酶、或报道的3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A(HMG-CoA)还原酶、肉桂酰-辅酶A还原酶或乙醛脱氢酶活性的酶，或通过修饰所述的酶获得；

其中步骤c)中所述DHB脱氢酶是甲基丁醛还原酶、琥珀酸半醛还原酶、4-羟基丁酸脱氢酶、或醇脱氢酶；

其中所述步骤a)中所述酶由SEQ ID No.1所示，所述步骤b)中所述酶由SEQ ID No.7、SEQ ID No.10和SEQ ID No.202所示，所述步骤c)中所述酶由SEQ ID No.14、SEQ IDNo.16、SEQ ID No.32、SEQ ID No.34、SEQ ID No.36、SEQ ID No.185和SEQ ID No.187所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述苹果酰-辅酶A还原酶与超嗜热古菌丙二酰-辅酶A还原酶野生型酶相比包括在以下位点的一个突变：Y206，其中在所述位点自然占据的氨基酸被其它19种天然存在的蛋白氨基酸的任意一种取代，即被丙氨酸，精氨酸，天冬酰胺，天冬氨酸，半胱氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸，组氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，丝氨酸，苏氨酸，色氨酸，或缬氨酸的任意一种取代。

3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中步骤a)，b)和c)通过异体表达至少一种酶的经修饰微生物进行，该酶表现如步骤a)，b)和c)中描述的酶活性。

4.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中步骤a)，b)和c)在相同的微生物中进行。

5.一种用于提高2,4-DHB生产的经修饰微生物，其中所述微生物表达的基因用于编码酶，该酶是催化权利要求1-3任一项中定义的步骤a)，b)和c)必须的，其中步骤a)中的酶由SEQ ID No.1所示，步骤b)中的酶由SEQ ID No.7、SEQ ID No.10和SEQ ID No.202所示，步骤c)中的酶由SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.32、SEQ ID No.34、SEQ ID No.36、SEQ ID No.185和SEQ ID No.187所示。

6.根据权利要求5所述的微生物，所述微生物是细菌或酵母菌。

7.根据权利要求6所述的微生物，其中所述细菌选自肠杆菌科、梭菌科、芽孢杆菌科、链霉菌科、链球菌科、甲基杆菌科、和棒状杆菌科。

8.根据权利要求6所述的微生物，其中所述细菌为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌、丙酮丁醇梭菌、甲基扭曲杆菌、或乳酸乳球菌。

9.根据权利要求6所述的微生物，其中所述酵母菌选自酵母科，毕赤酵母科，和裂殖酵母科。

10.根据权利要求6所述的微生物，其中所述酵母菌为酿酒酵母，粟酒裂殖酵母，乳酸克鲁维酵母，马克斯克鲁维酵母，杰丁毕赤酵母，树干毕赤酵母或毕赤酵母。