[发明专利]一种2;4-二羟基丁酸的生产方法

说明书

本发明涉及一种制备2,4‑二羟基丁酸(2,4‑DHB)的方法，包括以下连续步骤：将苹果酸，琥珀酰‑辅酶A和/或乙醛酸转化为苹果酰‑辅酶A，将之前获得的苹果酰‑辅酶A转化为苹果酸‑4‑半醛，和使用DHB脱氢酶将苹果酸‑4‑半醛转化为2,4‑DHB。

技术领域

本发明涉及一种由苹果酸和/或乙醛酸和/或琥珀酰-辅酶A生产2,4-二羟基丁酸的新方法，该方法通过实现合成途径将苹果酸和/或乙醛酸和/或琥珀酰-辅酶A转化为苹果酰-辅酶A，将苹果酰-辅酶A转化为苹果酸-4-半醛，然后将所述苹果酸-4-半醛转化为2,4-二羟基丁酸(2,4-DHB)。

背景技术

本发明中提及的羧酸在其盐形式(例如2,4-二羟基丁酸盐)或酸形式(例如2,4-二羟基丁酸)下是等同命名的。

2,4-二羟基丁酸(等同于2,4-DHB或DHB)是经济效益很可观的化合物。通过调整适合的pH值，可以在水介质中容易地将DHB转化为α-羟基-γ-丁内酯。α-羟基-γ-丁内酯是生产在动物营养品中有很大市场的蛋氨酸替代物2-羟基-4-(甲硫基)-丁酸酯(HMTB)的重要前体(US2009/318715)。目前，α-羟基-γ-丁内酯通过多阶段反应衍生自γ-丁内酯，所述多阶段反应为γ-丁内酯在α位置的卤化，和随后在碱性介质中以羟基取代卤素原子的反应(US 2009/318715)。

由于油价上涨，需要从可再生资源生产DHB。微生物能够将源自生物质的原料，如糖或有机酸，转化为大量各种不同的化学成分(Werpy & Petersen，2004)。随着生物化学和基因组学信息量的增长，可以修饰微生物以使其能以高产率和产量过量生产自然生成的代谢中间体(Bailey，1991)。生产微生物的优化经常需要合理的代谢网络工程，以确保其中目标代谢物的生物合成所需酶的过量表达，并减轻产物的反馈抑制。另外的可能性是使用能催化目标代谢物生产的新酶系统。

代谢工程方法和酶催化需要生化和产生目标代谢物的代谢途径调节方面的详细知识。关于生产DHB的这些信息是无法获得的。仅有少量研究报道了琥珀酸半醛脱氢酶缺乏症患者产生2,4-DHB(Shinka等人2002)，然而没有确定2,4-DHB生产中涉及的酶反应。因此，2,4-DHB的发酵或酶生产需要(i)确定能将易得到的前体转化为2,4-DHB的热力学可行途径，(ii)确定或构建途径中能够催化各反应步骤的酶和(iii)在适合的生物生产中，途径酶的功能表达。

本发明目的是为满足这些需求。

发明内容

因此，本发明的一个目标是生产2,4-DHB的方法，包括第一步将苹果酸和/或乙醛酸和/或琥珀酰-辅酶A转化为苹果酰-辅酶A，第二步将苹果酰-辅酶A转化为苹果酸-4-半醛，和第三步将苹果酸-4-半醛转化为2,4-DHB。

因此，本发明的一个目标是生产2,4-DHB的方法，其包括第一反应(见图1)，其中苹果酸通过与具有苹果酰-辅酶A合成酶活性的酶反应转化成苹果酰-辅酶A[1.1]，和/或其中琥珀酰-辅酶A通过与具有琥珀酰-辅酶A:(L)-苹果酰-辅酶A转移酶活性的酶反应转化成苹果酰-辅酶A[1.2]，和/或其中乙醛酸通过与具有苹果酰-辅酶A裂解酶活性的酶反应转化成苹果酰-辅酶A[1.3]。在第二反应中[2]，苹果酰-辅酶A通过与具有苹果酰-辅酶A还原酶活性的酶反应转化成苹果酸-4-半醛。在第三反应中[3]，苹果酸-4-半醛通过与具有DHB脱氢酶活性的酶反应转化成DHB。更确切地说，反应[3]在生物合成路径中被具有苹果酸-4-半醛还原酶活性的酶催化。

在本发明的另一个方面，生产2,4-DHB方法的第一步涉及分别具有苹果酰-辅酶A合成酶(等同于名为苹果酸硫激酶或苹果酸-辅酶A裂解酶(ADP形式)EC 6.2.1.9)、琥珀酰-辅酶A:(L)-苹果酸辅酶A转移酶(EC2.8.3.-)，或苹果酰-辅酶A裂解酶(EC 4.1.3.24)活性，其分别将苹果酸、琥珀酰-辅酶A、或乙醛酸转化为苹果酰-辅酶A。