[发明专利]含有MHC I型启动子的慢病毒载体

说明书

本发明涉及将来自MHC I型基因启动子的启动子序列插入慢病毒载体中以指导转基因的转录，所述转基因优选编码在哺乳动物细胞宿主(优选APC(DC))中表达的免疫原性多肽。本发明包括这些载体，制备载体的方法和使用载体的方法，包括医疗用途。

技术领域

本发明属于重组疫苗技术的领域并涉及慢病毒载体的改进，其可用作治疗性和预防性疫苗。包含MHC I型(MHCI)启动子的载体提供了优于其他载体的改进的特性。

背景

重组疫苗已随重组DNA技术的进步而发展，允许修饰病毒基因组以产生修饰的病毒。通过这种方式，已能够将遗传序列引入非致病性病毒，从而其编码待在感染后于靶细胞内表达的免疫原性蛋白质，以在其宿主内发展特定免疫应答。

此类疫苗构成了疫苗技术中的重大进步(Kutzler等,Nat Rev Genet,9(10):776-788,2008)。具体而言，其具有优于传统疫苗的优势：避免活(减毒的)病毒和消除与灭活疫苗制造相关联的风险。

采用经修饰的逆转录病毒(逆转录病毒载体)的基因递送在上世纪80年代早期由Mann等描述(Cell,33(1):153-9,1983)。最常用的致瘤性逆转录病毒基于莫洛尼(Moloney)鼠白血病病毒(MLV)。其基因组简单，多聚蛋白质Gag、Pol和Env从该基因组产生并且需要以反式形式进行病毒复制(Breckpot等，2007,Gene Ther,14(11):847-62；He等，2007,ExpertRev vaccines,6(6):913-24)。一般以顺式需要的序列是长末端重复序列(LTR)及其如下周边序列：整合所需的反向重复序列(IR或att位点)、包装序列Ψ、转运RNA结合位点(引物结合位点，PBS)，和涉及逆转录的一些其它序列(正链起始必需的LTR内的重复R以及多嘌呤序列(PPT))。为了生成复制缺陷型逆转录病毒载体，通常使gag、pol和env基因全部缺失，并且用表达盒替代。

源自慢病毒基因组的逆转录病毒载体(即慢病毒载体)已涌现为用于基因治疗和免疫治疗目的的有希望的工具，因为它们显示优于其它病毒系统的若干优势。具体而言，慢病毒载体本身无毒，并且不像其它逆转录病毒，慢病毒能够转导非分裂细胞，尤其是树突细胞(He等，2007,Expert Rev vaccines,6(6):913-24)，这允许通过内源性通路的抗原递呈。

慢病毒通过遗传组成相似性、复制的分子机制和与其宿主的生物相互作用连接。最为熟知的是其为长期亚临床感染后潜伏起始并缓慢发展的慢病综合征的病因；因此，其被称为“慢”病毒(Narayan等，1989,J Gen Virol,70(7):1617-39)。其基本构成与所用逆转录病毒相同但由于附属基因(例如vif、vpr、vpu、nef、tat和rev)的存在而更为复杂，所述附属基因在慢病毒的体内复制中起关键作用。

慢病毒代表逆转录病毒科(Retroviridae)的一个慢病毒属，其包括人免疫缺陷病毒(HIV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、马传染性脑炎病毒(EIAV)、山羊关节炎脑炎病毒(CAEV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)和猫免疫缺陷病毒(FIV)。慢病毒可以无限地持续存在于其宿主内，并且在一生的感染期间以不同速度连续复制。病毒在其宿主内的持续复制取决于其避开宿主防御的能力。

重组整合型慢病毒载体的设计基于慢病毒的顺式与反式作用序列的分离。非分裂细胞中的有效转导需要慢病毒基因组中存在两种顺式作用序列：中心多嘌呤序列(cPPT)和中心终止序列(CTS)。这导致形成称为中心DNA“瓣(flap)”的三链DNA结构，该结构使基因进入非分裂细胞(包括树突细胞(DC))核内的效率最大化(Zennou等，2000,Cell,101(2)173-85；Arhel等，2007,EMBO J,26(12):3025-37)。

树突细胞对于抗原递呈而言具有重要作用，因为其构成了以递呈抗原和起始免疫应答为主要功能的抗原递呈细胞(APC)的主要类型。