[发明专利]使用重组负链RNA病毒载体表达异源蛋白质的方法

权利要求书

1.一种在细胞中表达至少一种异源核酸序列的方法，所述方法包括：

通过用包含至少一种异源核酸序列的重组负链RNA病毒载体感染细胞，将所述至少一种异源核酸序列引入至所述细胞中，

其中所述重组负链RNA病毒载体包含编码导致病毒基因组复制能力丧失而病毒转录能力不丧失的突变的P蛋白的病毒基因组，和

其中所述至少一种异源核酸序列编码细胞重编程或编程因子或治疗性蛋白质。

2.根据权利要求1所述方法，其中所述重组负链RNA病毒载体为副粘病毒包括仙台病毒，副流感病毒，鸡新城疫病毒，腮腺炎病毒，麻疹病毒，牛瘟病毒和人类呼吸道合胞体病毒，或弹状病毒载体包括水疱性口炎病毒或狂犬病病毒。

3.根据权利要求1或2所述方法，其中所述P蛋白的突变为仙台病毒P蛋白的氨基酸序列2-77的一个或多个氨基酸的缺失、插入或替换，或如果不是仙台病毒，则为与仙台病毒P蛋白的氨基酸序列2-77同源的氨基酸序列的缺失、插入或替换。

4.根据权利要求3所述方法，其中所述突变为

(a)仙台病毒P蛋白的氨基酸2-77的缺失或，如果病毒不是仙台病毒，则为与仙台病毒P蛋白的氨基酸2-77同源的氨基酸的缺失，或

(b)仙台病毒P蛋白的氨基酸33-41的缺失或，如果病毒不是仙台病毒，则为与仙台病毒P蛋白的氨基酸33-41同源的氨基酸的缺失。

5.根据权利要求1-4任一项所述方法，其中所述细胞重编程因子选自由Nanog、Oct-3/4、Sox2、c-Myc、Klf4、Lin28、ASCL1、MYT1L、TBX3b、SV40大T、hTERT、miR-291、miR-294、miR-295及其组合组成的组，和/或其中所述编程因子选自由神经生长因子(NGF)、纤维母细胞生长因子(FGF)、白细胞介素-6(IL-6)、骨形成蛋白(BMP)、神经源素3(Ngn3)、胰腺十二指肠同源框1(Pdx1)、田安(Mafa)及其组合组成的组。

6.根据权利要求1-5任一项所述方法，其中所述治疗性蛋白选自由腺苷脱氨酶(ADA)、p91-PHOX、因子IX、因子VIII、囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)、β-球蛋白(HBB)、抗肌萎缩蛋白、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)、苯丙氨酸羟化酶(PAH)、葡糖苷酰鞘氨醇酶(GBA和GBA2)、原纤蛋白-1(FBN1)、亨廷顿蛋白(HTT)、载脂蛋白B(apoB)、低密度脂蛋白受体(LDLR)、低密度脂蛋白受体衔接蛋白1(LDLRAP1)、前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)、α突触核蛋白(SNCA)、帕金(PRKN)、富含亮氨酸重复激酶2(LRRK2)、PTEN诱导的推断的激酶1(PINK1)、帕金森蛋白7(DJ-1)、ATP酶型13A2(ATP13A2)、肿瘤自杀基因产物、抗血管生成因子、自体肿瘤抗原包括酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)和癌胚抗原(CEA)、免疫刺激因子、生长因子包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和上皮生长因子(EGF)、细胞因子包括白介素IL-2、IL-4、IL-5、IL-12和IL-17、免疫抑制剂及其组合组成的组。

7.根据权利要求1-6任一项所述方法，其是将至少部分分化的细胞重编程为较低分化的细胞或将要被编程的细胞编程至所需分化状态的体外方法，所述方法包括：

(a)提供来自供体的至少部分分化的细胞或要被编程的细胞，

(b)通过用包含至少一种异源核酸序列的重组负链RNA病毒载体感染步骤(a)所提供的细胞，将所述至少一种异源核酸序列引入至所述细胞中，和

(c)在能有效表达所述至少一种异源核酸序列的条件下培养受感染的细胞，

其中所述至少一种异源核酸序列编码细胞重编程或编程因子。

8.根据权利要求7所述方法，其中所述至少部分分化的细胞为选自由终末分化的体细胞、前体细胞、谱系限制性干细胞、成体干细胞和祖细胞组成的组的哺乳动物细胞。

9.根据权利要求7或8所述方法，其中至少部分分化的细胞被重编程为寡能、专能或多能细胞。

10.根据权利要求7所述方法，其中要被编程的细胞为终末分化的体细胞。