[发明专利]使用重组负链RNA病毒载体表达异源蛋白质的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种使用复制缺陷的但有转录能力的重组负链RNA病毒在细胞中表达至少一种异源核酸序列的方法。特别地，本发明涉及将细胞重编程为较低分化状态的体外方法和使用所述重组负链RNA病毒载体的体内和体外基因治疗方法。此外，本发明涉及由所述体外方法制备的细胞或细胞群和所制备的细胞或细胞群作为药物的用途。

背景技术

重组病毒载体为已知可用于将外源基因引入哺乳动物细胞中以介导稳定的转基因表达的几种试剂中的一种。已将不同的病毒用于该目的，包括逆转录病毒，疱疹病毒，腺病毒，和腺相关病毒。这些重组病毒因其在病毒疫苗生产中的用途和作为基因治疗载体用于治疗基因缺陷疾病而被知晓。重组病毒的其它应用包括通过逆转录病毒或慢病毒介导的转导和特定细胞的重新分化和重编程因子的表达而将细胞去分化为被称作诱导性多功能干细胞(iPS)的多能细胞。

在上述病毒介导方法中，与基因传递相关的一个严重问题是来自病毒载体的遗传物质整合到宿主细胞基因组DNA中，这可导致宿主细胞的恶性转化。特别地，逆转录病毒介导的基因(例如编码重编程因子的基因)传递，可导致转基因的基因组整合。这可能会触发原癌基因的激活或破坏肿瘤抑制基因，导致细胞的恶性转化。与整合病毒载体相关的另一个问题是整合的和下调的转基因可被重新激活导致细胞转化。

其它问题包括用于基因传递的病毒可被传递到患者的邻近的健康细胞或从患者传递到其他个体或环境中的可能性。另一个问题是所述病毒载体可能存留并造成不良影响，如对病毒成分的免疫反应或病毒性感染的延迟效应。此外，长期的外源基因的表达可导致对自身抗原的类自身免疫反应或干扰细胞过程如信号通路。

为了增加在体外和体内过程中外源基因传递到宿主细胞的安全性，尤其是考虑到所述病毒载体的不期望的传播，已提出不同的策略。例如，在WO 2006/084746 A1中描述了复制缺陷的但有转录能力的负链RNA病毒。由于其改进的安全性，这种病毒被描述为适合作为活疫苗使用。

此外，为避免基因插入靶细胞基因组中引起的任何问题，尝试引入不在靶细胞基因组中整合的病毒基因构建体并允许异源基因产物的瞬时表达。例如，WO 2010/008054 A1描述了一种用染色体非整合的病毒载体如仙台病毒(Sendai virus)载体生产类ES(胚细胞)细胞的方法。然而，该病毒载体能在被感染的靶细胞中有效复制，并因此所生成的病毒颗粒将在每次细胞分裂后的子细胞中均匀分布。因此，所产生的类ES细胞在它们的细胞质中包含不需要的高病毒载量。

在WO 2010/134526 A1中描述了相似的方法，其中仙台病毒载体被用于将体细胞重编程为诱导性多能干细胞(iPS)，所述仙台病毒载体不导致载体序列整合入宿主细胞的基因组中，并因此降低由载体序列随机整合入宿主基因组引起的致瘤性转化的风险。然而，由于WO 2010/134526 A1中所描述的仙台病毒载体是有能力复制的，在重编程后需要付出相当大的努力去除它以确保足够的安全性。此外，由于在WO 2010/134526 A1使用的用于去除所述病毒的siRNA的递送率(delivery rate)和siRNA介导的表达抑制都没有达到100％，该方法不能充分的排除与使用活病毒相关的健康风险。

发明目的

考虑到现有技术，本发明的目的是提供一种具有改进的安全性且能在足够长的时期内有效地表达异源核酸序列的新型病毒载体。特别地，本发明旨在提供用于在靶细胞中传递和表达编码治疗性蛋白质的基因的方法，作为用于多种疾病的基因治疗方法。此外，本发明旨在传递和表达编码细胞重编程或编程因子的基因以将至少部分分化的细胞重编程为适合在再生治疗中使用的较低分化的细胞或将细胞编程为具有所需分化状态的细胞。

发明概述

第一方面，本发明涉及一种在细胞中表达至少一种异源核酸序列的方法。所述方法可为体内或体外方法且包含通过用包含至少一种异源核酸序列的重组负链RNA病毒载体感染细胞将至少一种异源核酸序列引入至细胞中的步骤，其中所述重组负链RNA病毒载体包括编码导致病毒基因组复制能力丧失而病毒转录能力不丧失的突变的P蛋白的病毒基因组，和其中所述至少一种异源核酸序列编码细胞重编程或编程因子或治疗性蛋白质。