[发明专利]用于鉴定具有基因毒性的化合物的蛋白表达分析

说明书

本发明涉及用于筛选具有(前-)基因毒性活性的化合物的方法，所述方法通过提供能够表达一组确定的蛋白的系统，用待筛选的化合物温育至少部分系统，将系统中的蛋白表达与对照系统中的蛋白表达相比较，从而检测(前-)基因毒性活性来进行。本发明的另一个方面涉及用于通过测定从哺乳动物取出的生物样品中确定的蛋白的表达水平来鉴定发生生理和/或病理状况的方法，所述状况通过响应给需要这样的治疗的哺乳动物施用的化合物而导致的增殖、分化和/或损伤修复的失调引起、介导和/或传播。本发明还涉及用于筛选具有(前-)基因毒性活性的化合物的试剂盒，其包含特异性结合标志蛋白的抗体。

化合物的潜在基因毒性的全面评价在化学药品危险性评估和药物开发过程中是非常重要的部分。目前的标准测试组合包括被设计来检测通过多种不同作用机制诱导DNA损伤的化合物的体外和体内测试。需要细菌回复突变测定以及在体外和/或体内利用哺乳动物细胞进行的基因毒性测试。由于在这些测试中被测试为阳性的化合物是潜在人的致癌物，因此基因毒性测试系统的重要性增加。然而，标准测试组合具有低通量，从而需要相当大量的化合物。为此，这些测试在早期药物发现阶段是不太适合的(Westerink等人,2011,Mutat.Res.724,7-21)。

通常地，原本不是体内基因毒素或不通过致诱变或DNA反应性机制诱导肿瘤的化学药品在哺乳动物细胞测试中产生假阳性结果，这使人的危险外推复杂化。

此外，根据EU REACH法规中的化学药品表征和现代风险评价，机理分析日益变得重要。

困难现正在强迫新的体外工具的发展。需要具有增加的特异度(即更少的假阳性结果)而不丢失灵敏度(即检测DNA反应性致癌物和体内基因毒素)的新型基因毒性测试系统(Kirkland等人,2005,Mutat.Res.584,1-256；Kirkland等人,2006,Mutat.Res.608,29-42；Kirkland等人,2008,Mutat.Res.653,99-108)。

因此，形成本发明的基础的技术问题是提供用于筛选化合物的方法，所述方法有效地使得能够鉴定和表征它们的基因毒性和/或前基因毒性性质。本发明的另一个问题是提供用于检测基因毒性和/或前-基因毒性活性的试剂盒。

本发明通过提供用于筛选具有基因毒性和/或前-基因毒性活性的化合物的方法来解决问题，所述方法包括测定至少两种蛋白(选自p-p53(Ser15)、p21、p-H2A.X(Ser139)、p-ATM(Ser1981)、p-Chk1(Ser345)、p-ATR(Ser428)、p-cdc2(Thr14/Tyr15)、Gadd45a和p-Chk2(Thr68))的活性形式在利用一种或多种化合物温育的系统中的表达水平相对于所述蛋白在大体上未用所述化合物或相同浓度的所述化合物温育的系统中的表达水平的步骤。

本发明人已令人惊讶地显示至少两种所述蛋白的组合与基因毒性相关。因此，前述多种标志蛋白代表新型基因毒性标志物，所述标志物十分适合用于区分基因毒性的阶段。下面的蛋白(the underlying proteins)被选择为差异表达分析的结果。通过针对未处理细胞的独特差异来表征所有蛋白的表达，其中经处理的细胞显示体现于上调的差异。在本领域中已描述了所测定的蛋白的序列和其它特征，但在本发明的定义的组合中缺乏与基因毒性的联系。配对标志蛋白组合(任选地补充以另外的标志蛋白)的任一个可用于最大限度的测试可靠性。蛋白可能以另一种方式命名，但唯一地通过被许多数据库例如UniProt、SwissProt等(参考资料表1；Zhou和Bartek,2004,Nat Rev Cancer4,216-25)普遍接受并已于其中注册的登录号来定义。

虽然所鉴定的9种蛋白参与DNA-损伤-反应信号-传导网络，但它们并不一定如目前已知的，以它们的实体在功能或位置上发生关联，但不排除这样的联系出现在组的单个成员或更多成员之间。