[发明专利]增强转基因植物中的蛋白稳定性

说明书

序列提交

本申请与电子形式的序列表一并提交。所述序列表定名为2312129PCTSequenceListing.txt，于2013年3月8日生成，大小为13kb。所述电子形式的序列表中的信息是本申请的一部分，其整体通过引用并入本文。

发明背景

本发明涉及植物分子生物学领域，更具体地涉及转基因植物中的基因表达稳定化。

本文中用于例示本发明背景的出版物和其他材料，特别是提供关于实践的额外详情的实例，以其公开的所有内容的整体通过引用并入，方便起见，在下文中按照作者和日期引用，并按照作者的字母顺序列于附加参考文献中。

转基因表达在转基因植物品系中随插入事件(event)而变化很大。筛选许多转基因事件却只获得具有期望的转基因表达水平的一或几个品系屡见不鲜。因此能够增强转基因表达水平的任何技术会对基础植物生物学研究以及农作物生物技术具有价值。

过去，对转基因表达的优化主要集中在转录上，通过增加启动子强度和增强组织特异性表达。对于源于非植物来源的转基因，人们试图通过使用病毒5'非翻译前导、优化起始密码子周围的序列和将变换密码子选择为植物偏爱密码子来增加翻译效率(Streatfield,2007)。关于mRNA脱帽和降解通路(Xu and Chua,2011)以及小RNA介导的转录后基因沉默(Mallory and Vaucheret,2010)知识的最新进展也引发了对转录子稳定性的重要性的认知。相比之下，对于如何增强转基因来源蛋白产物的稳定性的研究相对较少。两个课题组报道了编码序列与泛素(Ub)C-末端的融合能增加蛋白累积(Garbarino et al.,1995；Hondred et al.,1999)，然而在这些实例中，翻译效率和蛋白稳定性的相对贡献并未确定。

所有植物蛋白均具有固有的半衰期，这取决于它们的功能和细胞定位。代谢酶普遍比信号通路成分更稳定，因为后者的快速更新是其调节机制的一部分(Henriques et al.,2009)。大多数植物信号通路终止于调节基因网络转录的蛋白因子。拟南芥基因组编码超过2,000种转录因子(TF)基因(Mitsuda and Ohme-Takagi,2009)，它们的调节重要性促使研究人员使用过表达研究TF功能和调节网络，并给转基因农作物赋予新的性状(例如抗旱性)。然而，当过表达几种转录因子基因时，仅引起微弱的表型(Xie et al.,2001)或根本没有表型，因为转基因表达水平受到蛋白稳定性而非mRNA水平限制(Seo et al.,2003；Jang et al.,2005；Jang et al.,2007)。

除定位于细胞器例如质体和线粒体的植物蛋白之外的大多数植物蛋白由泛素/26蛋白酶体(泛素/蛋白酶体)通路降解(Vierstra,2009)。在该通路中，蛋白中的降解基序(例如PEST序列)发出泛素化信号，泛素化蛋白继而被运送到26S蛋白酶体破坏(Fu et al.,2010)。现有证据表明，泛素化蛋白在蛋白酶体颗粒的入口处以某种方式解折叠，当解折叠的蛋白穿过26S蛋白酶的通道时被降解(Voges et al.,1999)。理论上，任何能够干涉泛素/蛋白酶体途径中的一或多个步骤的机制预期延长蛋白半衰期；然而，该干涉并非特异性的，会对蛋白稳定性和累积产生普遍效果，这并非人们所期望的。为了克服特定蛋白的不稳定性，有必要鉴定能够顺式给予稳定性的可移植(portable)的氨基酸序列。Heessen et al(2005)报道了这种序列，其使用源于酵母RAD23蛋白的泛素相关(UBA)2(UBA2)结构域(本文也指其序列)增加不稳定的GFP报道分子蛋白在酵母中的稳定性，其中所述GFP报道分子蛋白因与泛素融合而不稳定。有趣的是，来自相同RAD23蛋白的UBA1序列据证实无活性(Heessen et al,2005)。

因此，对于植物生物技术，人们期望增强并稳定转基因植物中的转基因表达水平。

发明概述

本发明提供增强转基因植物中的蛋白稳定性的组合物和方法。所述组合物是编码融合蛋白的核酸构建体、融合蛋白、转基因植物细胞和转基因植物。根据本发明的融合蛋白包含感兴趣的蛋白和本文所述的UBA结构域。所述方法使用所述核酸构建体在转基因植物细胞或转基因植物中生产融合蛋白。所述融合蛋白具有比所述感兴趣的蛋白更高的稳定性，并且与所述感兴趣的蛋白具有相同的功能。