[发明专利]免疫组库分析中样品污染的检测和定量

说明书

本申请是以下每一个美国专利申请的部分继续申请案(continuation-in-part)：2013年3月15日提交的系列号13/835,093和2013年3月15日提交的系列号13/834,794，并且要求来自以下的优先权：2012年4月13日提交的美国临时申请系列号61/624,002；2012年6月11日提交的系列号61/658,317；2012年12月17日提交的系列号61/738,277；和2013年2月22日提交的系列号61/768,269；前述申请的每一个通过应用以其整体并入本文。

发明背景

随着DNA测序的每个碱基成本已经下降，并且测序技术已变得更可靠和方便，正在使用大规模DNA测序开发越来越多的诊断和预后应用，例如，Faham和Willis，美国专利公布2010/0151471；Freeman等人，Genome Research,19:1817-1824(2009)；Boyd等人,Sci.Transl.Med.,1(12):12ra23(2009)；He等人，Oncotarget(March 8,2011)；Palomaki等人Genet.Med.,14(3):296-305(2012)；Kohlmann等人，Semin.Oncol.,39(1):26-36(2012)。特别是，编码免疫分子，诸如T细胞或B细胞受体，或其组分的核酸谱，包含了关于生物体的健康或疾病的状态的大量信息，使得已提出了此类谱作为用于各种状况的诊断或预后指标的用途，例如Faham和Willis(以上引用)；Boyd等人(以上引用)；He等人(以上引用)。此外，此类基于序列的谱能够有比基于扩增的编码CDR区的尺寸分布、由微阵列序列取样、来自PCR扩增子的杂交动力学曲线或其他方法大得多的灵敏度，例如Morley等人，美国专利5,418,134；van Dongen等人，Leukemia,17:2257-2317(2003)；Ogle等人，Nucleic Acids Research,31:e139(2003)；Wang等人，BMC Genomics,8:329(2007)；Baum等人，Nature Methods,3(11):895-901(2006)。

然而，与在采用扩增步骤的其他基于DNA的测定中一样，污染或交叉污染DNA的存在可降低采用免疫组库(immune repertoire)测序的测定中检测的有效限值(effective limit)。污染DNA的来源包括测定试剂、设备，操作者的处理、气溶胶等，例如Urban等人，J.Forensic Sci.,45(6):1307-1311(2000)；Kwok,142-145页,于Innis等人，编著，PCR Protocols(Academic Press,1990)。

癌症的微小残留病(minimal residual disease，MRD)的检测受这样的污染影响。对于许多癌症进行治疗的患者常常保留与癌症相关的MRD。即，即使患者可具有响应于治疗的由临床测量的疾病的完全缓解，因某种原因或其他原因避开破坏的小部分癌细胞可得以保留。该残留群体的类型和尺寸是患者的继续治疗的重要预后因素，例如Campana,Hematol.Oncol.Clin.North Am.,23(5):1083-1098(2009)；Buccisano等人,Blood,119(2):332-341(2012)。因此，MRD的测量越灵敏，随后的治疗过程将越可能成功，例如Szczepanski等人，Best Pract.Res.Clin.Haematol.,15(1):37-57(2002)。已开发了用于评估该群体的几种技术，包括基于流式细胞仪、原位杂交、细胞遗传学、核酸标志物的扩增等的技术，例如Buccisano等人，Current Opinion in Oncology,21:582-588(2009)；van Dongen等人，Leukemia,17(12):2257-2317(2003)；等。由于此类区段(本文还称为“克隆型(clonotype)”)通常具有可用作用于其相关癌症细胞的分子标签的独特序列，编码重组免疫受体的区段(即克隆型)的核酸的基于PCR和序列的分析对于评估白血病和淋巴瘤中的MRD是特别有用的，例如Van Dongen等人(如上引用)；Faham和Willis，美国专利公布2011/0207134；等。然而，此类技术的灵敏度仍受到来自其他个体的交叉污染的存在的限制。