[发明专利]使用受体Na/K-ATPase/Src复合物进行的测定法和基于细胞的测试及其用途

说明书

发明人：谢子建，Joseph I.Shapiro，赖芳芳

相关申请的交叉引用

本申请要求美国临时申请序列号61/664,232(提交于2012年5月8日)的权益，其全部公开明确地通过引用并入本文。

关于联邦资助研究的声明

本发明在美国政府支持下进行，基金编号为HL-109015，由美国国立卫生研究院基金编号颁布。美国政府拥有本发明的特定权利。

本发明技术领域及工业应用

本发明涉及操作方法，其筛选受体Na/K-ATPase/Src的激动剂和拮抗剂，并涉及鉴定不饱和脂肪酸、二硫化谷胱甘肽(GSSG)和有机硫化合物衍生物鉴定为部分激动剂，鉴定MB-5、姜黄素、姜黄素衍生物、丹参素、丹参酮、丹参酮衍生物、黄芪甲苷IV和阿魏酸为受体拮抗剂。

发明背景

癌症是全球死亡发生的主要致因。根据世界卫生组织(WHO)统计，2008年癌症在世界范围引起的死亡为760万例，占总死亡的约13％，预期这一数字到2030年为止会增加到1200万例。充血性心脏衰竭(Congestive Heart Failure，CHF)的发生率也呈上升趋势，在美国有500万人受其影响。1000名70岁以上人群中有大约8人被诊断为患有CHF。

因为受体Na/K-ATPase/Src复合物的激动剂造成的生理刺激对正常的肾、心和肺功能的维持十分重要，且其能保护器官，所以对受体Na/K-ATPase/Src复合物的激动剂的开发是有益的。因为持续的刺激会导致异常生长(肿瘤)和器官纤维化，所以拮抗剂的开发可用于癌症和慢性器官退行疾病的治疗剂。

Na/K-ATPase在维持细胞、器官和整个身体中电解质和液体平衡中起作用。哺乳动物细胞的Na/K-ATPase与多种膜及细胞溶胶蛋白质相互作用，由此起到信号传导受体的作用。Src是一种非受体酪氨酸激酶，能与Na/K-ATPase形成受体复合物并调节细胞生长、分化、凋亡和纤维化，见图1的示意图。

生理浓度的强心类固醇对Src受体复合物的激活在肾脏、心血管功能调节上有重要作用。此外，Src受体复合物的持续激活导致ROS应激反应，其促进多种疾病的发生，包括癌症、高血压、先兆子痫，终末期肾病，充血性心脏衰竭和糖尿病。

Na/K-ATPase酶广泛表达于大多数真核细胞中并对维持跨膜离子梯度至关重要，其通过将Na⁺泵出细胞并将K⁺泵入细胞。在结构上，该酶由两个非共价连接的α和β亚基构成。Na/K-ATPase的α亚基具有10个跨膜结构域，其N-和C-末端都位于细胞质中。α亚基由数个得到良好表征的结构域构成：执行子(A)结构域由N-末端和第二个连接于跨膜螺旋M2和M3的细胞溶胶结构域(CD2)构成；高度保守的不连续磷酸化(P)结构域靠近质膜；以及一个相对分离的核苷酸结合(N)结构域。在离子泵循环中，这些结构还显示有A和N结构域的显著运动。在传输循环中，A结构域旋转，而N结构域闭合，这开启了(E1)并关闭了(E2)A、N和P结构域。

先前，本发明人和其他人员已经证明强心类固醇(Cardiotonic Steroid，CTS)如乌本苷与Na/K-ATPase的结合刺激多个蛋白质激酶的级联效应。此外，Src的敲除消除了这些激活效应中的大部分。Src作为Src家族非受体激酶家族的成员之一，在很多细胞外刺激即细胞因子、生长因子和应激反应的信号转导通路中起重要作用，而且是特定癌症和骨病中进行治疗干预的良好靶标。

Na/K-ATPase与Src通过至少两个结合基序直接相互作用：一个基序在α1亚基的CD2和Src SH2之间；另一个涉及到第三细胞溶胶结构域(CD3)和Src激酶结构域。所形成的该Na/K-ATPase和Src的复合物起受体作用，由此引发蛋白质激酶的级联效应。

例如，乌本苷与Na/K-ATPase的结合会破坏后者的相互作用然后导致不同通路的组装和激活，包括ERK级联反应、PLC/PKC通路及线粒体中ROS产生。此外，这种相互作用使Src保持失活状态。因此，Na/K-ATPase起到内源Src负调节子的作用。见例如共同发明人的待审申请：美国出版号2011/0245167(出版于2011年10月6日)、PCT/US07/023,011(提交于2007年10月17日(出版号为WO2808/054792，2008年5月8日)，其要求美国序列号60/855,482(提交于2006年10月16日)的优先权，这些申请明确地通过引用并入本文。