[发明专利]细胞转染方法

权利要求书

1.产生包含基因修饰的生殖细胞的禽类的方法，所述方法包含：

(i)将转染混合物注入禽类胚胎的血管中，所述转染混合物包含：

(a)一或多种多核苷酸，其中所述一或多种多核苷酸的至少一种待插入所述禽类胚胎中的一或多个生殖细胞的基因组中；

(b)转染试剂，其包含阳离子脂质；和

(c)转座酶，靶向性核酸酶，或编码转座酶或靶向性核酸酶的多核苷酸，且由此所述至少一种多核苷酸插入所述禽类胚胎中的一或多个生殖细胞的基因组中，以及

(ii)将所述禽类胚胎在足以使所述禽类胚胎发育成小鸟的温度下孵育。

2.权利要求1的方法，其中所述转染混合物被注入处于阶段13-14的禽类胚胎。

3.权利要求1的方法，其中所述转染试剂包含选自如下一或多种的单价阳离子脂质：DOTMA(N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵)、DOTAP(1,2-双(油酰氧基)-3-3-(三甲基氨)丙烷)、DMRIE(1，2-双十四烷基氧基丙基3-二甲基-羟基乙基铵溴化物)和DDAB(二甲基双十八烷基溴化铵)。

4.权利要求1的方法，其中所述转染试剂包含选自如下一或多种的多价阳离子脂质：DOSPA(2，3-二油基氧基-N-[2-(精胺羧酰胺)乙基]-N，N-二甲基-1-丙铵三氟醋酸盐)和DOSPER(1，3-二油酰基氧基-2-(6-羧基精胺基)丙酰胺)、TMTPS(四甲基四棕榈酰精胺)、TMTOS(四甲基四油烯基精胺)、TMTLS(四甲基四月桂基精胺)、TMTMS(四甲基四肉豆蔻基精胺)和TMDOS(四甲基二油烯基精胺)。

5.权利要求4的方法，其中所述转染试剂包含DOSPA(2，3-二油基氧基-N-[2-(精胺羧酰胺)乙基]-N，N-二甲基-1-丙铵三氟醋酸盐)。

6.权利要求1的方法，其中所述转染试剂进一步包含中性脂质。

7.权利要求6的方法，其中所述中性脂质包含DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺)、DPhPE(二植烷酰磷脂酰乙醇胺)或胆固醇。

8.权利要求7的方法，其中在转染试剂与多核苷酸混合之前，所述转染试剂包含3:1w/w的DOSPA和DOPE的混合物。

9.权利要求1的方法，其中插入基因组的多核苷酸包含编码转座子的核苷酸序列。

10.权利要求9的方法，其中所述转染混合物包含转座酶或编码转座酶的多核苷酸。

11.权利要求10的方法，其中编码所述转座酶的多核苷酸是RNA。

12.权利要求9的方法，其中所述转座子选自Tol2、mini-Tol2、Sleeping Beauty和PiggyBac。

13.权利要求1的方法，其中所述靶向性核酸酶是锌指靶向性核酸酶、TALEN靶向性核酸酶或CRISPR靶向性核酸酶。

14.权利要求1的方法，其中所述生殖细胞是原生殖细胞。

15.权利要求1的方法，其中所述注入混合物被注入蛋壳中的胚胎，所述胚胎在所述蛋壳中发育。

16.权利要求1的方法，其中插入基因组的多核苷酸编码包含双链区域的RNA分子。

17.权利要求16的方法，其中所编码的RNA分子是siRNA、shRNA或RNA诱饵。

18.权利要求1的方法，其中插入基因组的多核苷酸编码多肽。