[发明专利]细胞转染方法

说明书

本发明涉及转染细胞的方法。具体地，本发明涉及转染禽类中原生殖细胞的方法，以及繁殖具有修饰性状的禽类的方法。

技术领域

本发明涉及转染细胞的方法。具体地，本发明涉及转染禽类中原生殖细胞的方法，以及繁殖具有修饰性状的禽类的方法。

背景技术

用以开发转基因或基因修饰禽类的有效技术的发展对于农业和生物制药产业，以及通过功能基因组学研究增加我们对禽类生物学的了解均至关重要。在面临人口增长时，家禽生产在确保全球食品安全中将扮演重要角色，当今生物技术的进步，例如转基因家禽的发展将有助于该产业满足增产的需求。

更具体地，应用转基因技术修饰家禽中无法通过传统育种获得的性状，例如抗病性和性别决定调节，如今成为可能，并为家禽产业提供巨大好处。对于生物制药蛋白的需求迅速增长，直到最近仍在使用基于细胞的体外制造系统，其生产用于疾病治疗的新重组蛋白。转基因家畜作为重组蛋白生产的生物反应器的应用如今正发展为昂贵且劳动密集的基于细胞的系统的主要替代。鸡转基因技术的发展使得鸡蛋被开发成用于高水平生产和纯化生物制药蛋白的生物反应器。

也有试图导入选定的外源基因，其通过将所述外源基因克隆入逆转录病毒载体(例如网状内皮病毒或禽类白血病病毒)，将重组病毒注入受精卵，允许病毒感染发育中的胚胎(例如原生殖细胞)从而建立嵌合性腺或卵细胞，以及使用得到的重组体尝试将外源基因导入后代。然而养禽业不愿意商业化使用该技术，因为病毒(处于天然状态)是病原体，甚至不同的复制活性的病毒载体某些时候能引起肿瘤，而复制非活性变体需要较高或反复的剂量。甚至复制缺陷的病毒构建体也能造成与内源病毒包膜重组从而变成复制活性的风险。另外，这些载体目前局限于尺寸相对较小(例如2kb或更小)的DNA插入片段。

也有试图将外源DNA注入通过手术从母鸡中取出的未发育的受精卵中。然而，该方法需要将发育的胚胎在一系列代孕容器中孵育。另外，其需要专门的产卵群体(layingflock)和反复的练习以获得所需的手术和技术技能。

可替代的方法包括将基因修饰的胚胎细胞或原生殖细胞(PGC)注入产卵后不久的受体胚胎。在该方法中，生成PCG培养物，其保留了分化成功能性卵细胞或精子的能力，所述卵细胞或精子在整合入发育的胚胎中时产生细胞。该类型的PCG培养物能被基因修饰，然后注入受体胚胎。所述受体胚胎通常会通过γ辐照修饰，削弱内源原生殖细胞，从而给予被注入的细胞定植于性腺嵴的选择优势。被修饰的细胞继而会成熟并产生能够将转基因传递到至少下一代的精子或卵细胞。然而，该技术因其需要将PGC从供体胚胎中移除，及其后续培养并重新导入受体胚胎而非常耗时。另外，使用该技术所能获得的包含基因修饰的PGC的禽类的效率很低。

因此，仍有对基因修饰禽类原生殖细胞的方法的需求。

发明概述

本发明人发现，将与DNA混合的转染试剂直接注入发育的禽类胚胎血液中导致DNA被导入原生殖细胞(PGC)，并且所述DNA插入所述禽类的基因组。

相应地，本发明提供用于产生包含基因修饰的生殖细胞的禽类的方法，所述方法包含：

(i)将包含与转染试剂混合的多核苷酸的转染混合物注入禽类胚胎的血管中，由此所述多核苷酸插入所述禽类中的一或多个生殖细胞的基因组中。

在一个实施方案中，所述方法进一步包含(ii)将所述胚胎在足以使所述胚胎发育成小鸟的温度下孵育。

所述转染混合物优选被注入处于约阶段12-17PGC迁移时的禽类胚胎。在一个优选实施方案中，所述转染混合物被注入处于阶段13-14的禽类胚胎。

尽管任意适合的转染试剂均可用于本发明的方法，但优选包含阳离子脂质的转染试剂。