[发明专利]高转导效率的rAAV载体、组合物及其使用方法

说明书

本发明提供了AAV衣壳蛋白，所述衣壳蛋白包含对VP3区中表面暴露的赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸和/或酪氨酸残基之一或其组合的修饰。本发明还提供了含有本发明之AAV衣壳蛋白的rAAV病毒体以及编码本发明之AAV衣壳蛋白的核酸分子和rAAV载体。有利地，与野生型rAAV载体和病毒体相比，本发明的rAAV载体和病毒体具有提高的转导多种目的细胞、组织和器官的效率。

发明的背景

相关申请的交叉引用

本申请要求于2013年3月15日提交的美国专利申请No.13/840,224(未决)和于2012年5月15日提交的美国临时专利申请No.61/647,318(未决)的优先权权益。本申请还涉及于2009年12月31日提交的美国专利申请No.12/595/196(于2013年5月21日授权为U.S.8,445,267)、于2008年4月8日提交的国际专利申请No.PCT/US2008/059647(进入国家)、于2007年4月9日提交的美国临时专利申请No.60/910,798(期满)、于2013年3月29日提交的美国专利申请No.13/854,011(未决)和于2013年4月2日提交的美国专利申请No.13/855,640(未决)。上述各申请各自的内容均在此通过专门引用以其整体并入。

关于联邦政府资助的研究或开发的声明

不适用。

发明的技术领域

通过使用病毒来递送治疗性遗传物质，在基因治疗领域中已取得了重大进步。由于其低免疫原性以及能够有效地转导非分裂细胞，腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)作为用于基因治疗的高效病毒载体已引起了相当大的关注。已显示，AAV感染多种类型的细胞和组织，并且在过去十年内，使这种病毒系统适用于人基因治疗已经取得了显著进展。

在其正常“野生型”形式中，重组AAV(rAAV)DNA以长度约为4600个核苷酸(nt)的单链分子被包装进病毒衣壳中。通过病毒感染细胞后，细胞的分子机制将单DNA链转化成双链形式。

AAV具有很多特性，这些特性有利于将其用作基因递送载体：1)野生型病毒不与任何病理性人状况(condition)相关；2)重组形式不含天然病毒编码序列；以及3)在很多应用中已经观察到持久的转基因表达。基因治疗的主要障碍之一(即诱导针对载体来源的和转基因来源之表位的细胞免疫应答中的免疫竞争)，可通过复制缺乏和缺乏由重组AAV表达的病毒蛋白质来克服。

重组腺相关病毒载体的转导效率在体外和体内的不同细胞和组织中变化很大。已进行了系统性研究来阐明AAV生活周期中的基本阶段。例如，据记载，被表皮生长因子受体蛋白酪氨酸激酶(EGFR-PTK)在酪氨酸残基处磷酸化的细胞蛋白质FKBP52在体外和体内均抑制AAV第二链DNA合成，从而抑制转基因表达。还已证明，EGFR-PTK信号转导调节泛素/蛋白酶体途径介导的细胞内运输以及FKBP52介导的AAV载体第二链DNA的合成。在这些研究中，抑制EGFR-PTK信号转导导致AAV衣壳蛋白的泛素化降低，其转而通过限制蛋白酶体介导的AAV载体的降解来促进核转运，表明EGFR-PTK介导的AAV衣壳上酪氨酸残基的磷酸化。

发明概述

本发明提供了AAV衣壳蛋白，其包含对VP3区中表面暴露之赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸和/或酪氨酸残基之一或其组合的修饰。本发明还提供了包含本发明之AAV衣壳蛋白的rAAV病毒体以及编码本发明之AAV衣壳蛋白的核酸分子和rAAV载体。有利地，与野生型rAAV载体和病毒体相比，本发明的rAAV载体和病毒体具有提高的转导多种目的细胞、组织和器官的效率。