[发明专利]用于补偿在对粒子进行荧光测量期间试剂老化的方法，以及实施该方法的生物分析设备

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于补偿在对用荧光试剂标记的粒子(包括细胞)进行荧光测量期间荧光试剂随时间降解的方法。

本发明的领域更具体地(但不穷尽地)是生物分析设备领域，且尤其是血液学设备领域。

现有技术

细胞分析以及尤其是血细胞分析需要使用允许初步化学处理样品的特定试剂。执行不同的物理化学功能，如稀释，染色或选择性破坏特定细胞群体(差异性裂解)。

这些试剂被封装在适合用于分析设备(如自动血液学分析器或流式细胞仪)的容器中。通常是给予每一试剂单一化学功能，但当前的倾向是从成本或使用简单性的考虑来看给予同一种试剂数种功能。对于产品制造商和使用者两者的维持简单性也是令人希望的目标。

当我们希望制造提供数种同时存在的物理化学功能的单一试剂时仍然存在困难：该试剂的不同化合物可能彼此反应，产生物理化学功能与原始产物显著不同的副产物。这种变化或降解可能改变样品(尤其是血液)的初步处理，且可能反映在不正确的分析结果中。

试剂的变化或降解还可能取决于环境因素，如温度或电磁辐射。具体来说，用于试剂中的某些荧光化合物以取决于温度的降解速率在水相中降解。对于噻唑橙(TO)尤其是这种情况，它是用作细胞组分染色剂的荧光化合物且旨在变成附着到胞内DNA或RNA上。

包括荧光化合物(如TO)的试剂值得注意地描述在文件FR 2 821 428中。这些试剂可以用于血液学系统，如描述在例如文件WO 2006/024716中。试剂的荧光化合物的降解引起荧光水平降低，这可能引起在所分析的细胞的计数和分类上的误差。

杂环聚甲炔(其包括TO)在分子氧存在下的分解(或光分解)是已知的。强力氧化剂(如过氧化氢)的存在也会引起TO降解，并且形成经鉴别的降解产物之一苯并噻唑酮。然而，TO的降解甚至在不存在光的情况下也会发生，并且加入抗氧化剂或用惰性气体(如氩气)代替溶解氧并不能减缓这种降解。看起来，血液学试剂中TO的降解由分子的自发水解引起。

配制某些试剂以便限制或至少减缓这种降解，例如在文件US 7 638 290中描述的那些。然而，这不足以保证化合物随时间的良好稳定性。

为了防止或抑制在水性介质中变化或降解的现象，荧光化合物可以按高度浓缩形式储存在有机溶剂中并且在测量时进行稀释，如描述在例如文件EP 2 175 340中。实际上，在如乙醇或乙二醇的有机溶剂中，几乎不存在荧光化合物的变化或降解，这相对于水性溶剂是一个真正的优势。

然而，这种进行方式具有其他缺点。有必要实际上在分析器内采用大量容器，这对于管理分析实验室或血液学实验室内的产品数目来说也产生更高费用。

此外，当化学试剂必须在使用之前实际上在分析器内或在置放在旁边的装置中复原时，也由于最终有必要进行两种或更多种液体(它们的粘度并不始终相同)的混合而增加了使用的复杂性。这可能产生产品均质性的问题，这些问题可能引起样品的不良处理。必须使用具有或多或少完美效率的混合器，这会产生额外的成本并且增加分解的风险。

本发明的一个目标是提出一种用于测量或至少评估试剂老化的方法。

本发明的另一个目标是提出一种用于补偿由于试剂老化引起的荧光测量值误差的方法。

本发明的另一个目标是延长所用试剂的保质期。

本发明的另一个目标是提出一种代表试剂在它的寿命期间(包括在运输期间(如果可适用的话))已暴露的温度的指标。

本发明的披露

这些目标是用一种用于补偿包括至少一种荧光化合物的储存在水相中的试剂的降解并且允许鉴别粒子的方法实现的，包括对测量用所述试剂标记的粒子的荧光水平FLUOm(t)的步骤，其特征在于该方法进一步包括以下步骤：

-在接近所述荧光水平FLUOm(t)测量的时间点的一个时间点t下在至少一个波长下对所述试剂的溶液进行吸光度测量，以便测定该试剂的至少一个当前光密度OD(t)，并且，

-使用该无降解试剂的所述一个或多个当前光密度OD(t)和至少一个初始光密度OD(0)计算这些荧光水平测量值的校正。

根据实施例：

-该无降解试剂可以如在生产结束时；

-吸光度测量可以在对应于一种荧光化合物的一个吸收峰值的至少一个波长下执行；

-这些粒子可以是如细胞或可以包括细胞。

该试剂可能尤其包括：

-至少一种聚甲炔型的荧光化合物，

-噻唑橙。

根据实施例，根据本发明的方法可以包括以下步骤：