[发明专利]用于生产萜烯的方法

说明书

发明领域

本发明涉及用于在真菌中生产萜烯的方法、修饰的萜烯生物合成基因簇、以及构巢曲霉(Aspergillus nidulans)用于生产多种类型的萜烯的用途。

相关领域的描述

萜烯是具有多种药学和工业应用的一大类化合物。萜烯可作为潜在的药物或药物前体、生物活性化合物或燃料和化学品。这些应用的实例是抗疟的倍半萜紫穗槐二烯(amorphadiene)、抗癌的二萜紫杉醇和倍半萜法呢烯，其可作为燃料和作为化学品的前体。单萜，例如柠檬烯，具有作为喷气燃料成分的应用。

萜烯是从宽范围的生物体中的五碳前体分子合成的一类生物生成的分子。萜烯是纯的碳氢化合物，而萜类化合物可含有一个或多个氧原子。术语萜烯和萜类化合物可互换使用。萜类化合物仅在植物和某些微生物中少量天然产生。然而，微生物生产是生产多种萜烯的吸引人的替代。尤其是真菌具有低营养需求，可以抵抗木质纤维素水解产物上的抑制剂，能够使用多种碳源，并且也适合大规模生产，因此提供了所探求的成本合算的方式以生产萜烯化合物。已经通过在异源/组成型启动子下的途径中表达某些基因而工程改造了若干微生物，用于萜烯生产。

这些经遗传改造的微生物宿主中的一个问题就是因生物体中存在的天然活性所致的低产量的结果或产生副产物。

编码生物合成途径中的连续步骤的基因倾向于在染色体上簇集在一起形成“基因簇”。簇集程度在生物体内部和之间是高度可变的。次级代谢物是对生物体正常生长而言并非必需的化合物。它们的作用是在生态相互作用中作为防御化合物或信号转导分子。许多次级代谢物都具有吸引人的生物学性能，例如作为抗生素、抗癌药、杀虫剂、免疫抑制剂和除草剂。在细菌中，控制这些化合物的生物合成的基因簇集在事实上是很普遍的。然而，真核基因组也含有功能相关的、但并非同源的基因簇[Osbourn，2010]。

很多用于次级代谢物合成的簇可以在丝状真菌中找到。与从先前鉴定的代谢物所预测的基因簇相比，丝状生物包含多得多的用于次级代谢物生物合成的基因簇。次级代谢的基因簇是用于代谢物生产的自含式的盒。它们含有编码产生不同类型的次级代谢物的骨架结构的酶的基因，所述酶例如非核糖体肽合成酶(NRPS)酶、聚酮合酶(PKS)和萜烯合酶，其称为“标签”基因/酶。这些簇也含有用于修剪修饰次级代谢物骨架的酶的基因，所述酶例如氧化还原酶、甲基转移酶、酰基转移酶和糖基转移酶。在某些情况下，次级代谢簇也包括用于途径-特异性调节剂的基因和/或途径终端产物抗性的基因[Osboum，2010]。

次级代谢簇的表达通常处于环境和/或发育控制之下并且是由复杂的调控级联所介导，所述级联将信号传递给途径-特异性开关。Zn(II)2Cys6-型转录因子的作用是通过上调簇集基因的转录而作为次级代谢物簇的途径-特异性激活物。次级代谢物基因的簇集具有在染色质水平上促进调控的潜力。某些次级代谢物簇内的基因的特定顺序和位置可提供有助于确定基因活化的时间和顺序的结构框架。已经提出该过程组织贯穿途径中的酶步骤的连续的底物通道[Roze等人，2007]。功能相关基因的簇集的优势是需要共同调节生物合成或发育途径中的一组基因控制的连续步骤。簇集促进了一组生物合成基因的最佳调控。

已经证实基因间隔区和染色体定位在优化基因表达中起作用。许多次级代谢物簇位于染色体的亚端粒区，其中异染色质转录受到位置调控。位于亚端粒区的某些簇显示出受到通用转录激活物例如LaeA或AreA的调节，其响应环境刺激以释放异染色质区用于翻译。在这些区中的基因转录在正常生长条件下沉默。当外源基因随机整合到宿主生物的基因组上时，位置转录调控可在靶基因的基因表达中发挥作用[Palmer等人，2010]。

除了随机整合的转化DNA造成的基因破坏所导致的不可预见的多效性外，已经提出某些染色体位置比其他位置更加有利于异源表达，也许是因为与局部调节元件的特定相互作用，或更常见的是在正常高度表达的基因附近的活性天然转录[Davis等人，1991]。当从其原始基因座上被取代时，某些在空间或时间上被调控的曲霉基因，例如黄曲霉毒素簇[Chiou等人，2002]和分生孢子-特异性基因[Miller等人，1987]，显示出在调控反应中的巨大变化，并且也已报道了对异源表达的基因座作用[Verdoes等人，1995]。