[发明专利]磨光白蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明一般涉及从溶液中纯化白蛋白的方法。更具体地，本发明涉及通过疏水性电荷-感应色谱树脂磨光富含白蛋白的溶液的方法。

背景

大部分商品人血清(HSA)使用基于最初由Cohn等人[1946]研发的那些乙醇沉淀法和随后Kistler & Nitschmann的改进[1962]制备。使用这些方法分离基于血浆蛋白在不同乙醇浓度、pH、离子强度和温度下的溶解度。然而，用于纯化白蛋白的Cohn纯化方法的主要缺陷在于应用高达40％v/v的乙醇浓度并且需要在低于0℃的温度下进行操作。尽管如此，但是通过乙醇沉淀连续成功地进行白蛋白纯化主要归因于如下事实：这些方法在加工现代血浆分级分离方法中遇到的大体积时极为有效。

较少、但递增量的白蛋白目前使用色谱法作为最初乙醇分级分离后的最终磨光步骤[More & Harvey,1991]或完全整合的色谱法[Marrs,1993；Yap等人,1993；Martins等人,2011；Berglof等人,1983]分级分离。HSA的色谱纯化具有大量有益性，包括较高收率、较高纯度[More & Harvey,1991；Yap等人,1993；Véron等人,1993]。较低的聚集性和改善的耐受性和临床安全性[Che等人,2006]，例如，最初由Berglof等人[1983]研发的色谱法开始应用于上清液II+III进料液流并且包括应用两种离子交换和大小排阻柱。该方法随后适用于脱脂质化的上清液I进料液流以调节高IgG，产生用于Intragam P的色谱法[Yap等人,1993；Bertolini等人,1999]。

尽管存在这些有益性，但是用于人白蛋白分级分离的色谱法的广泛适用性有限，这归因于在工业化规模上与这些方法操作相关的无效性。此外，用于例如Berglof等人[1983]报道的这样的方法阴离子和阳离子交换色谱步骤涉及俘获/结合白蛋白至树脂。白蛋白与阴离子和阳离子交换柱的正结合是指蛋白质载量限于≤100g/L。这在工业化应用方面存在局限，原因在于人血浆包含白蛋白作为主要蛋白质(约占总蛋白的60-70％)且白蛋白的色谱纯化由此需要较大的柱(≥200L)和多次循环。对于使用凝胶过滤步骤最终磨光HSA以除去高分子量杂质蛋白的全色谱法而言，这尤其是显而易见的。维持有效分离所需的低流速和小样品载量使得该步骤成为色谱白蛋白制备方法中的显著瓶颈。

本发明通过提供用于磨光富含白蛋白溶液的更有效方法解决或至少部分缓解了本领域中的问题。

发明概述

在本发明的一个方面中，提供了磨光白蛋白以除去污染物的方法，包括使富含白蛋白的溶液通过疏水性电荷-感应色谱树脂并且回收通过该树脂的白蛋白溶液。

在一个实施方案中，所述疏水性电荷-感应色谱树脂包含4-巯基乙基吡啶。

在一个实施方案中，富含白蛋白的溶液选自Cohn上清液I、Cohn上清液II+III、来自Kistler-Nitschmann的上清液或滤液、Cohn上清液IV和Cohn级分V。在一个实施方案中，富含白蛋白的溶液是渗滤的Cohn上清液I。在一个实施方案中，来自Kistler-Nitschmann的上清液或滤液是上清液/滤液A或B。

在一个实施方案中，富含白蛋白的溶液是在血浆或渗滤的Cohn上清液I就白蛋白而言以负模式通过膨胀床吸附树脂时回收的流过的溶液。

在一个实施方案中，富含白蛋白的溶液是脱脂质化的和优球蛋白耗尽的。

在一个实施方案中，在富含白蛋白的溶液通过疏水性电荷-感应色谱树脂前，所述方法包含如下步骤：(a)使所述溶液就白蛋白而言以负模式通过阴离子交换树脂；和(b)使所述溶液就白蛋白而言以负模式通过阳离子交换树脂。在一个实施方案中，所述方法包含使来自步骤(a)的阴离子交换树脂的级分流过步骤(b)中的阳离子交换树脂。在另一个实施方案中，所述方法包含使来自步骤(b)的阳离子交换树脂的级分流过步骤(a)中的阴离子交换树脂。

在一个实施方案中，所述方法包含对磨光的白蛋白溶液进行巴氏灭菌。

在本发明的另一个方面中，提供了通过本文公开的方法回收的磨光的白蛋白溶液。

在本发明的另一个方面中，提供了通过本文公开的方法生产的巴氏灭菌的白蛋白溶液。

在本发明的另一个方面中，提供了包含磨光的白蛋白溶液并且具有小于5NTU的浊度的组合物。在一个实施方案中，该组合物包含：

(a)大于80mM的钠；

(b)大于19％w/v的白蛋白；