[发明专利]基于适体的多重测定

说明书

相关申请

本申请要求于2012年6月7日提交的美国临时申请序列号61/656,956的权益，所述临时申请通过引用整体并入本文。

发明领域

本发明一般涉及经设计以改良基于适体的多重测定的性能的方法、装置、试剂和试剂盒。此类方法在诊断应用以及生物标记物探索和研究工具的设计与开发及基于适体的治疗剂的开发中具有广泛效用。具体地说，提供了用于减少或消除背景信号的材料和方法。

背景

以下描述提供了与本公开相关的信息的汇总，而不是承认本文中所提供的任何信息或所参考的任何出版物是在要求保护的本发明之前的技术。

针对生物样品和其它样品中的生理学上重要的分子的检测和定量的诸多测定在科学研究和卫生保健领域是重要的工具。一类所述测定涉及使用包括一个或多个被固定在固体支持物上的适体的微阵列。所述适体各自能够以高特异性方式且以极高亲和力结合靶分子。参见例如标题为“Nucleic Acid Ligands”的美国专利号5,475,096，还参见例如美国专利号6,242,246、美国专利号6,458,543和美国专利号6,503,715，各专利的标题为“Nucleic Acid Ligand Diagnostic Biochip”。一旦微阵列与样品接触，适体就结合样品中所存在的其各自的靶分子，且从而能够测定靶分子在样品中不存在、存在、量和/或浓度。

还描述了多重适体测定，所述测定提供了经设计以去除测定混合物的特定组分的基于溶液的靶相互作用和分离步骤，参见美国专利号7,855,054和7,964,356及美国公布号US/2011/0136099和US/2012/0115752。所描述的适体测定方法使用一个或多个特异性捕获步骤从欲检测的靶标分离测试样品的组分，同时分离适体-靶标亲和复合物。

许多测定形式的敏感性和特异性因检测方法在测定期间从由于非特异性缔合产生的信号中解析真信号且产生可检测信号的能力而受到限制。这对基于适体的多重测定尤其如此。已经观察到，此类型测定中的非特异性结合的主要来源之一是非预期适体-适体相互作用的功能。由于靶标/适体相互作用取决于维持靶特异性适体的结构特征，所以减少适体-适体相互作用的任何方法都需要受到制衡，以便不减少特异性/靶适体相互作用。本公开描述了消除单一或多重适体测定中的背景同时维持靶标/适体特异性相互作用的方法。

发明概要

本公开提供了经设计以改良单一分析物和基于适体的多重测定的性能的方法、装置、试剂和试剂盒。具体地说，提供了用于减少或消除背景信号的材料和方法。

在一个实施方案中，提供了对靶分子和第一可释放标签具有高亲和力和特异性的适体。在一些实施方案中，适体是光适体。在一些实施方案中，这种第一可释放标签是可光裂解生物素。描述了其它标签和可裂解部分及含有所述标签和可裂解部分的适体。

在与测试样品进行平衡结合之前，在溶液中将包含对靶分子具有特异性亲和力的第一可释放第一标签的适体固定在固体支持物上。适体与固体支持物的连接是通过使第一固体支持物与适体接触并且允许适体上所包括的可释放第一标签直接或间接地与连接到第一固体支持物或为第一固体支持物一部分的适当第一捕获剂缔合来实现。在连接之后，利用被缓冲到pH 11的溶液进行洗涤，以去除适体/适体聚集物，从而减少测定背景(下文定义的“Catch-0”固定)

然后制备测试样品并且与对其各自靶分子具有特异性亲和力的固定的适体接触。如果测试样品含有靶分子，则适体-靶标亲和复合物将在与测试样品的混合物中形成。注意，除适体-靶标复合物以外，未复合的适体也将连接到第一固体支持物上。然后将适体-靶标亲和复合物和已经与固体支持物上的探针缔合的未复合适体与混合物的其余部分分隔开，从而去除测试样品(样品基质)中的游离靶标和所有其它未复合物质，即，混合物中未与第一固体支持物缔合的组分。这个分隔步骤在本文中称为Catch-1分隔(参见以下定义)。在分隔之后，使用适用于所采用的特定可释放第一标签的方法从第一固体支持物释放适体-靶标亲和复合物以及任何未复合适体。