[发明专利]人乳头瘤病毒病毒样颗粒的高效提纯方法

说明书

本发明公开了一种人乳头瘤病毒（HPV）L1蛋白的高纯度和高效提纯方法。根据所述提纯方法，当利用还原剂处理细胞匀浆而形成加热/冷却的时候，所提纯的HPV L1蛋白的纯度和产率大大地提高。此外，通过所述提纯方法提纯的HPV L1蛋白的VLP具有极佳的抗原性和免疫原性。

技术领域

本发明涉及具有极佳的结构和免疫学特性的人乳头瘤病毒(HPV)的病毒样颗粒(VLP)的高效提纯方法。

背景技术

HPV为引起约100％宫颈癌的病原体[1]。据报道，全世界每年有500,000位女性被诊断患有宫颈癌，并且250,000位女性死于宫颈癌[2]。16、18、45、31、33、52、58、35和59型被认为是为导致宫颈癌的高风险类型的HPV，而6和11型被认为是低风险类型的HPV[3,4]。特别地，HPV16和HPV18被认为导致全部宫颈癌的70％，并且因此被认为是是预防宫颈癌的最重要类型[5]。导致宫颈癌的HPV类型不同地区而有所不同[5]。在非洲、欧洲、北美以及中南美洲，HPV16、HPV18、HPV31和HPV45感染为宫颈癌的主要原因，在亚洲，HPV16、HPV18、HPV58和HPV33感染为宫颈癌的主要原因[5]。

HPV的衣壳由作为主要抗原的L1蛋白和作为次要抗原的L2蛋白组成[6]。在这里，L1蛋白已被用作用于预防宫颈癌的疫苗的抗原和用于诊断宫颈癌的抗原，因为其具有自组装形成病毒样颗粒(VLP)的特性[6,27]。重组L1蛋白在大肠杆菌(Escherichia coli)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、毕赤酵母(Pichia Pastoris)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)或草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda，Sf)细胞，或者植物细胞中作为表达细胞进行生产[7-12,28]。目前，商用宫颈癌疫苗为Gardasil^TM(Merck)和Cervarix^TM(GlaxosmithKline,GSK)。Gardasil^TM包括HPV16、HPV18、HPV6和HPV11作为抗原的L1VLP，并且Cervarix^TM包括HPV16和HPV18作为抗原的L1VLP[13]。Gardasil^TM使用酿酒酵母作为抗原表达细胞，Cervarix^TM使用草地贪夜蛾(Sf)细胞作为抗原表达细胞，其为昆虫细胞[13,14]。两种疫苗均通过肌肉注射而被注射，并且具有每剂120美元的高成本，三剂需要360美元[15]。由于商用宫颈癌疫苗的注射成本高，所述疫苗在发展中国家的广泛使用受到许多限制，而宫颈癌主要发生在发展中国家中[16]。据此，低成本和高效的宫颈癌疫苗的研发就仍将是一个重要的课题。

在使用重组蛋白的药物中，下游加工成本高至总制造成本的80％[17]。为了制造用于宫颈癌疫苗的抗原，使用了通过在下游加工中的数个提纯步骤来提高目标抗原纯度的方法[18]。在酿酒酵母中生产VLP的情况中，为了提高目标蛋白的纯度，主要使用蔗糖垫层超速离心或排阻层析。为了提纯VLP，Hofmann等使用蔗糖垫层超速离心、阴离子交换层析、硫酸铵沉淀和排阻层析[19]。Kim等相继地使用蔗糖垫层超速离心、排阻层析和阳离子交换层析来提纯VLP[7]。Park等使用的提纯方法包括硫酸铵沉淀、排阻层析和阳离子交换层析，其被相继地执行[20]。根据所述方法，可以获得高纯度VLP，但是所述方法会限制提纯装置的增大，并且不适用于在大规模生产中使用。