[发明专利]产生重组艾杜糖-2-硫酸酯酶的方法

权利要求书

1.一种用于在哺乳动物细胞中大规模产生重组艾杜糖2-硫酸酯酶(I2S)蛋白的方法，所述方法包括在含有缺乏血清的培养基的大规模培养皿中悬浮培养共表达重组I2S蛋白和甲酰甘氨酸生成酶(FGE)的哺乳动物细胞。

2.一种用于在哺乳动物细胞中大规模产生重组艾杜糖2-硫酸酯酶(I2S)蛋白的方法，所述方法包括在一定条件下，在含有缺乏血清的培养基的大规模培养皿中培养共表达重组I2S蛋白和甲酰甘氨酸生成酶(FGE)的哺乳动物细胞，以便所述细胞平均以大于约15皮克/细胞/日的比生产率产生所述重组I2S蛋白，并且另外地其中所述产生的重组I2S蛋白平均包含至少约60％的对应于人I2S蛋白的Cys59的所述半胱氨酸残基至C_α-甲酰甘氨酸的转化。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述培养步骤包括灌注工艺。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述灌注工艺具有在约0.5-2体积的新鲜培养基/反应器的工作体积/日(VVD)的范围内的灌注速率。

5.根据权利要求3所述的方法，其中所述灌注工艺具有在约0.05-5纳升每种细胞每日(nL/细胞/日)的范围内的细胞比灌注速率。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞平均以大于约30皮克/细胞/日的比生产率产生所述重组I2S蛋白。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞以至少6mg每升每日的平均收获滴度产生所述重组I2S蛋白。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述产生的重组I2S蛋白平均包含至少约70％的对应于人I2S蛋白的Cys59的所述半胱氨酸残基至C_α-甲酰甘氨酸的转化。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述产生的重组I2S蛋白包含至少约80％的对应于人I2S蛋白的Cys59的所述半胱氨酸残基至FGly的转化。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述产生的重组I2S蛋白包含至少约97％的对应于人I2S蛋白的Cys59的所述半胱氨酸残基至C_α-甲酰甘氨酸(FGly)的转化。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞为人细胞。

12.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞为CHO细胞。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述大规模培养皿为生物反应器。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述生物反应器为或大于10L、200L、500L、1000L、1500L或2000L的规模。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述培养基缺乏动物来源的组分。

16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述培养基为化学成分确定的培养基。

17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述培养基不含蛋白质。

18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述培养基包含至少一种氧化还原调节剂。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述至少一种氧化还原调节剂选自谷胱甘肽、葡萄糖-6-磷酸、肌肽、鼠尾草酚、萝卜硫素、生育酚、抗坏血酸、脱氢抗坏血酸、硒、2-巯基乙醇、N-乙酰半胱氨酸、半胱氨酸、核黄素、烟酸、叶酸、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述至少一种氧化还原调节剂包括半胱氨酸。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述半胱氨酸的浓度在约0.1mg/L至约65mg/L的范围内。

22.根据权利要求18-21中任一项所述的方法，其中所述至少一种氧化还原调节剂包括2-巯基乙醇。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述2-巯基乙醇的浓度在约0.001mM至约0.01mM的范围内。