[发明专利]产生重组艾杜糖-2-硫酸酯酶的方法

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2012年6月29日提交的美国临时专利申请系列号61/666,712的优先权；其完整内容在此通过引用并入。

序列表

在本说明书提及在2013年6月27日以电子形式提交的命名为“2006685-0339_SEQ_LIST”的ASCII.txt文件的序列表。所述.txt文件于2013年6月25日产生，并且大小为21KB。将序列表的全部内容通过引用并入本文。

背景

粘多糖贮积症II型(MPS II，亨特综合症)是因酶艾杜糖-2-硫酸酯酶(I2S)的缺乏而引起的X染色体连锁隐性溶酶体贮积症。I2S从葡糖氨基聚糖(GAG)硫酸皮肤素和硫酸乙酰肝素切割末端2-O-硫酸酯部分。由于亨特综合症患者中丧失I2S酶或存在有缺陷的I2S酶，因此GAG在多种细胞类型的溶酶体中逐渐累积，从而导致细胞肿胀，器官肿大，组织破坏和器官系统功能障碍。

一般而言，具有亨特综合症的人的身体表现包括躯体和神经症状。例如，在亨特综合症的一些病例中，中枢神经系统受累导致发育迟缓和神经系统的问题。而亨特综合症的非神经症状在出生时一般不存在，随着时间的推移，GAG在体内细胞中的渐进累积可能对身体的外周组织具有巨大影响。GAG在外周组织中的累积导致患者面部特征的鲜明粗糙度，并且造成前额突出、扁平桥和巨舌，此为亨特综合征患者的最典型特征。类似地，GAG的累积可不利地影响身体的器官系统。最初表现为心脏、肺和呼吸道的壁的增厚，以及肝、脾和肾的异常肿大，这些深刻的变化最终可导致广泛的灾难性器官衰竭。因此，亨特综合症总是严重的、进行性的和限制寿命的。

酶替代疗法(ERT)是用于治疗亨特综合症(MPS II)的批准的疗法，其包括向亨特综合症患者施用外源替代I2S酶。

发明概述

本发明除其它事项以外提供了用于大规模产生重组I2S酶以促进亨特综合症的有效治疗的方法。在本发明之前，使用含血清培养基的滚瓶贴壁培养系统已被成功地开发来大规模产生重组I2S。然而，本申请的发明人开发了这样的系统，该系统能使用无动物组分、化学成分确定的培养基在大规模器皿中有效地悬浮培养共表达I2S和甲酰甘氨酸生成酶(FGE)的哺乳动物细胞，以高效地产生大量重组I2S酶。出乎意料的是，使用无动物组分悬浮培养系统产生的重组I2S酶还已显著地改善了酶活性，因为以这种方式产生的重组I2S具有异常高水平的C_α-甲酰甘氨酸(FGly)(例如，高于70％和高达100％)，这是I2S的活性所需要的。此外，根据本发明产生的重组I2S酶具有独特的特征，例如唾液酸含量和聚糖图谱，这可以提高重组I2S蛋白的生物利用度。此外，无动物组分培养系统简化了下游纯化工艺，并减少或消除了血清来源的污染物如胎球蛋白。因此，本发明提供了大规模生产系统，该系统是更有效、具有成本效益、可重复的、更安全并产生更有效力的重组I2S。

因此，在一个方面，本发明提供了通过在含有缺乏血清的培养基的大规模培养皿中悬浮培养共表达重组I2S蛋白和甲酰甘氨酸生成酶(FGE)的哺乳动物细胞而用于在哺乳动物细胞中大规模产生重组艾杜糖-2-硫酸酯酶(I2S)蛋白的方法。在一些实施方案中，培养步骤包括灌注工艺。

在另一个方面，本发明提供了用于在哺乳动物细胞中大规模产生重组艾杜糖-2-硫酸酯酶(I2S)蛋白的方法，所述方法包括在一定条件下，在含有缺乏血清的培养基的大规模培养皿中培养共表达重组I2S蛋白和甲酰甘氨酸生成酶(FGE)的哺乳动物细胞，以便所述细胞平均以大于约15皮克/细胞/日的比生产率产生重组I2S蛋白，并且另外地其中产生的重组I2S蛋白平均包含至少约60％的对应于人I2S蛋白的Cys59的半胱氨酸残基至C_α-甲酰甘氨酸的转化。在一些实施方案中，培养步骤包括灌注工艺。