[发明专利]CHO表达系统

说明书

发明领域

本发明属于工业蛋白质生产领域。发明人设计并构建了包含编码人或家犬来源的谷氨酰胺合成酶的表达载体的新表达系统，以及CHO细胞系。更具体而言，本发明涉及以下各项的组合：(i)适用于产生重组蛋白的DNA载体，其中所述载体包含编码谷氨酰胺合成酶的序列，和(ii)中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系，其中所述GS包含与SEQ ID NO:1的序列或与SEQ ID NO:2的序列至少94.5％相同的序列。

背景技术

当以工业规模产生重组蛋白时，必需分离产生大量重组蛋白的克隆。

将异源基因引入动物宿主细胞并筛选加入的基因的表达是漫长且复杂的过程。该过程涉及转染和选择具有稳定的长期表达的克隆，和筛选重组蛋白的高表达率。

在从表达载体产生表达重组蛋白的克隆时，通常将宿主细胞用在同一载体上编码感兴趣的蛋白质和选择标记二者的DNA载体转染。这样的表达载体因而包含选择标记，其允许选择其中存在所述表达载体的克隆。这样的选择标记也可能导致共扩增的发生，由此允许高生产克隆的分离。

本领域已知数种这样的选择标记，包括例如G418、潮霉素、嘌呤霉素、新霉素、二氢叶酸还原酶(DHFR)、谷氨酰胺合成酶(GS)和次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)。特别是GS在工业重组蛋白生产领域广泛用作真核细胞中的选择标记。

更具体而言，WO 87/04462描述了谷氨酰胺合成酶(GS)作为选择标记的使用。实施例教导了一种表达载体，其包含作为选择标记的编码中国仓鼠来源的GS的序列。进一步显示了这样的表达载体允许在所述表达载体转染至CHO细胞中时产生重组蛋白，所述重组蛋白是tPA。

尽管早在八十年代就描述了上述基于使用GS作为选择标记的CHO表达系统，时至今日其仍然是本领域的标准。特别是对于所述原始GS选择标记尚没有显著改进发表。

实际上，韩国专利KR10-0267720公开了使用人GS作为选择标记。然而，使用的人GS的精确序列没有公开。另外，其还表明技术效果(高产率)仅与人GS和使用的特定SV40启动子二者相关联(即缺乏128-270位的SV40启动子)。

因此本领域需要另外的和/或改进的表达系统，其允许分离大量表达期望产生的重组蛋白的克隆，这些克隆中的至少一些展现出所述重组蛋白的高表达率。

发明内容

发明人惊讶地发现当在CHO细胞中产生重组蛋白时，使用人或家犬来源的GS比使用CHO来源的GS产生了更好的结果(参见例如图2和3)。

特别是发现了使用人来源的GS尤其有利，因为其允许分离比在使用CHO来源的GS时更多的表达所述重组蛋白的克隆，它们中的一些以比使用CHO来源的GS时更高的水平表达所述重组蛋白(参见例如图3)。

本发明的一个实施方案提供中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系，其包含脱氧核糖核酸(DNA)表达载体，并且其中所述载体包含编码异源哺乳动物谷氨酰胺合成酶(GS)的核苷酸序列和至少一个用于表达重组蛋白的表达盒，其中所述GS包含与SEQ ID NO:1的序列或与SEQ ID NO:2的序列至少94.5％相同的蛋白质序列；或SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的至少100个连续氨基酸的蛋白质片段。在本发明的另一个实施方案中，所述GS包含与SEQ ID NO:1的序列或与SEQ ID NO:2的序列至少94.5％相同的序列。在本发明的另一个实施方案中，所述GS包含与SEQ ID NO:1的序列至少97.5％相同的序列。在本发明的特定实施方案中，所述GS是人GS并且包含SEQ ID NO:1的序列。在本发明的另一个实施方案中，所述GS是家犬GS并且具有SEQ ID NO:2的序列。

在本发明的又另一个实施方案中，所述CHO细胞系包含脱氧核糖核酸(DNA)表达载体，并且所述载体包含编码异源哺乳动物谷氨酰胺合成酶(GS)的核苷酸序列和至少一个用于表达重组蛋白的表达盒，其中已使所述编码GS的序列的三联密码子偏向于在CHO细胞中的表达。在本发明的另一个实施方案中，所述编码GS的序列包含与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的序列至少80％相同的序列。在本发明的特定实施方案中，所述编码GS的序列包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的序列。在本发明的另一个实施方案中，将所述编码人GS的序列置于猿猴空泡病毒40(SV40)启动子的调控之下，并且所述重组蛋白是单克隆抗体。