[发明专利]分离不同胰腺细胞类型的方法

说明书

发明领域

本发明涉及分离在细胞混合群体中的特定细胞类型的方法。特别地，本发明涉及分离胰腺细胞中的不同细胞类型，包括生成胰岛素的胰岛β细胞，用于在糖尿病的治疗中使用。

发明背景

成熟功能性胰腺的β细胞通过胰岛素的控制分泌来调节代谢稳态。受损的β细胞功能和所导致的胰岛素分泌不足引起血液葡萄糖的持续高水平，其为糖尿病的标志。

1型糖尿病(T1D，也被称为胰岛素依赖型糖尿病，IDDM)是导致胰腺中β-细胞破坏的自身免疫性疾病。葡萄糖稳态的崩溃及疾病的临床表现被认为仅在80-90％的胰腺β细胞功能被免疫反应灭活后发生。初期糖尿病仅能在自身免疫过程开始后才可通过β细胞自身免疫的免疫标志物的检测来诊断。

2型糖尿病(T2D，旧称非胰岛素依赖型糖尿病，NIDDM，或成年型糖尿病)是糖尿病的最常见形式，占糖尿病病例的90％。其是以在相对的胰岛素抵抗和胰岛素缺乏的情况下的高血液葡萄糖为特征的代谢紊乱。肥胖是在遗传上易患T2D的人中该疾病的主要原因。2型糖尿病通过增加运动和改变饮食最初地控制。如果通过这些措施血糖没有降低，可能需要药物诸如二甲双胍或胰岛素。

目前对糖尿病的治疗是疑难的且无法排除很多与该疾病有关的长期并发症。因此，对开发改善的用于糖尿病的治疗很感兴趣。

成人胰腺包括内分泌和外分泌细胞群体。内分泌细胞位于朗格汉斯岛内，包括独立功能的各细胞型(例如生成胰高血糖素的α细胞、生成胰岛素的β细胞、生成促生长素抑制素的δ细胞等)。除了胰岛其自身的异质性之外，胰岛的制备经常被不同比例的外分泌细胞(包括以水解酶例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶为特征的胰腺细胞；及胰管细胞(Cleveland等人2012))及甚至非胰腺细胞污染。胰腺β细胞通过胰岛素的控制分泌来调节代谢稳态；受损的β细胞功能引起血液葡萄糖的持续高水平，其是糖尿病的标志。功能性胰腺β细胞的移植是治愈糖尿病的最有前途的方法之一(Shapiro等人2000,N Engl J Med 343(4):230-238；Serup等人2001,Bmj 322(7277):29-32)，但是目前受供体组织严重短缺的限制。这已经促成能体外生成功能性生成胰岛素的细胞的方法(Kroon等人2008,Nat Biotechnol 26(4):443-452；Russ等人2011,PLoS One 6(9):e25566)。尽管如此，细胞类型特异性表面标志物的缺乏是分离相关细胞的主要障碍。

正在进行的糖尿病全球性流行表明迫切需要改善的糖尿病治疗诸如基于细胞的疗法，因此对hESC衍生的胰腺前体有极大的兴趣。最近的结果已经表明hESC衍生的前体体内生成胰岛素的潜力(Kroon等人，Nat Biotechnol.2008,26,4,443-52)；但是该方案效率很低且产生高度异质的群体。因此，任何将来的临床应用或许会需要前瞻性鉴定并生成具有较高保真度的前体的群体。

目前用于细胞表面标志物的鉴定的方法基于流式细胞术、基因表达模式分析和免疫染色。基于抗体阵列的较高通量的蛋白质组学方法也已被用于剖析细胞表面标志物(Ko等人2005,Biomaterials 26(23):4882-4891)及基于不同地表达的标志物来区分细胞群体(Sharivkin等人Molecular&cellular proteomics 2012,11(9):586-595；和Belov等人Cancer Res.2001,61,4483-4489)。Sharivkin等人和Belov等人已经分别使用抗体阵列方法来筛选用于人类内胚层祖细胞和白血病的潜在的细胞类型特异的表面标志物。尽管这些平台对探索细胞表面标志物很有效，但其并不揭示特定标志物与特定功能的关联。

β细胞特异的表面标志物可便于胚胎β细胞祖细胞的鉴定和表征以及同质的生成胰岛素的细胞从源于hESC或再分化的β细胞的培养物的纯化。其也可允许成人β细胞的分离，从而有助于将来的诊断应用。一种可能对人类β细胞有选择性的细胞表面标志物是TMEM27。虽然最近已培育出针对这种抗原的抗体(Vats等人2012,Diabetologia 55(9):2407-2416)，但仍然不清楚其是否能够用来通过流式细胞术或其它方法纯化β细胞。