[发明专利]用于治疗、预防或缓解疼痛的融合蛋白和方法

说明书

本发明涉及非细胞毒性融合蛋白及其作为止痛分子的治疗性应用。

根据毒素对目标分子的作用类型，通常可将毒素分为两组。具体而言，第一组毒素杀死其天然目标细胞并因此称为细胞毒性毒素分子。该组毒素的示例包括植物毒素(如蓖麻毒蛋白和相思豆毒蛋白)和细菌毒素(如白喉毒素和假单胞菌外毒素A)。细胞毒性毒素受到了用于治疗细胞疾病和病症(如癌症)的“魔术弹”设计(例如免疫偶联物，其包含细胞毒性毒素组分和结合目标细胞上特定标记的抗体)的大量关注。细胞毒性毒素通常通过抑制细胞的蛋白合成过程杀死其目标细胞。

第二组毒素称为非细胞毒性毒素，顾名思义，这类毒素不会杀死其天然目标细胞。与细胞毒性毒素相比，非细胞毒性毒素受到的商业关注较少，并通过抑制除蛋白合成以外的细胞过程来发挥其对目标细胞的作用。非细胞毒性毒素由多种植物和多种微生物(梭菌属(Clostridium sp.)和奈瑟球菌属(Neisseria sp.))产生。

梭菌神经毒素是通常具有150kDa分子量的蛋白。其由多种细菌生产，特别是属于梭菌属的细菌，最重要的是破伤风梭菌(C.tetani)和肉毒梭菌(C.botulinum)、丁酸梭菌(C.butyricum)和阿根廷梭菌(C.argentinense)的几种菌株。存在8种不同类型的梭菌神经毒素，即破伤风毒素，和肉毒菌神经毒素的血清型A、B、C1、D、E、F和G，且其都共有类似的结构和作用模式。

梭菌神经毒素代表非细胞毒性毒素分子的主要组且由宿主细菌以单个多肽的形式合成，所述多肽通过蛋白水解切割事件进行翻译后修饰以形成由二硫键连接在一起的两条多肽链。这两条链被称为重链(H链，其分子量为约100kDa)和轻链(L链或LC，其分子量为约50kDa)。

L链具有蛋白酶功能(锌依赖的内肽酶活性)并对胞吐过程中涉及的囊泡和/或质膜相关蛋白表现出高底物特异性。来自不同梭菌物种或血清型的L链可水解三种底物蛋白(即突触小泡蛋白、突触融合蛋白或SNAP-25)之一中不同但特定的肽键。这些底物是神经分泌机制的重要组分。

奈瑟球菌属(最重要地，来自淋病奈瑟氏球菌(N.gonorrhoeae)物种)生成功能类似的非细胞毒性蛋白酶。这类蛋白酶的示例是IgA蛋白酶(参见WO99/58571)。

本领域中已充分证明，毒素分子可再次靶向不是该毒素天然目标细胞的细胞。再次靶向时，修饰的毒素能够结合所需目标细胞，随后易位至细胞溶质，能够对目标细胞发挥作用。所述再次靶向是通过使用不同的靶向部分(TM)代替毒素的天然TM来实现的。关于这一点，对TM进行选择使其结合所需目标细胞，并随后使修饰的毒素进入目标细胞内的内体。修饰的毒素也包含易位结构域以使非细胞毒性蛋白酶进入细胞溶质。该易位结构域可以是毒素的天然易位结构域或者起可以是获自具有易位活性的微生物蛋白的不同的易位结构域。

可通过本领域技术人员熟知的常规化学偶联技术实现上述TM替换。关于这一点，参见Hermanson,G.T.(1996)，Bioconjugate techniques(《生物偶联技术》)，学术出版社(Academic Press)和Wong,S.S.(1991)，Chemistry of protein conjugation and cross-linking(《蛋白偶联和交联的化学》)，CRC出版社(CRC Press)。或者，可使用重组技术，如WO98/07864中所述的那些。所有上述参考文献均通过引用纳入本文。

疼痛传感细胞具有大量受体类型。然而，不是所有的受体类型都适用于(至少是可用于)受体介导的胞吞。类似地，对于同一受体，不同TM之间的结合特性可广泛变化，这在不同TM和不同受体之间更为显著。

因此，需要研发能够解决一种或多种上述问题的修饰的非细胞毒性融合蛋白。特别感兴趣的是研发用于治疗疼痛的替代性/改良的非细胞毒性融合蛋白。

本发明试图通过提供独特的融合蛋白解决一种或多种上述问题。

本方面通过提供单链、多肽融合蛋白解决了一种或多种上述问题，包括：

a.非细胞毒性蛋白酶，该蛋白酶切割伤害性感觉传入神经的胞吐融合器(exocytic fusion apparatus)的蛋白；

b.结合伤害性感觉传入神经上结合位点的甘丙肽靶向部分，该结合位点胞吞整合入伤害性感觉传入神经内的内体；