[发明专利]荧光融合多肽、包含所述多肽的生物感应器及其用途

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其是荧光融合多肽、包含所述多肽的生物感应器及其用途。

背景技术

以下背景探讨仅用于促进读者对本发明的理解，并不应理解为描述或构成本发明的现有技术。

基于细胞体系的高容量筛选(HCS)使用活细胞作为生物研究工具，用于说明正常细胞和患病细胞的活动。HCS还用于发现和优化新备选药物。

高容量筛选是现代细胞生物学及其分子工具与自动化高解析度显微镜和机器人操作的结合。首先，令细胞接触化学试剂或RNAi试剂。然后，使用图像分析来检测细胞形态改变。使用各种技术，例如与内源蛋白融合的绿色荧光蛋白或荧光抗体，来测定细胞合成蛋白量的改变。

在细胞尺度上并行采集不同细胞性质的数据，例如信号级联传导活动和细胞谷歌完整性，是该方法的主要优势，与之相比，高通量筛选较快，但不够详细。虽然HCS相比较慢，但所得的丰富数据允许对药物作用的理解更深刻。在此意义上，HCS获取信号级联转导活动相关数据的目的之一，在于通过测量胞内第二信使水平，来测定不同药物在信号传导过程中的作用。

第二信使是从细胞表面的受体处接力将信号传递给细胞内细胞质或细胞核中的目标分子。他们接力传导荷尔蒙信号(例如肾上腺素、生长因子等)并引起细胞活动的某些改变。他们极大地放大信号强度。第二信使是信号级联转导的参与者之一。这些第二信使中，cAMP和钙是第二信使概念的范例，且被认为是普遍存在并调控许多细胞内关键过程的关键胞内分子。

理想状态下，所述测量要求精确定位、高动态范围的、以及尽可能少的细胞生理学干扰的工具，其能够使用高容量筛选方法来监控体内第二信使水平。

基于此，产生了各种基于荧光性质动态变化的荧光生物感应器。在此意义上，所述生物感应器种类通常基于荧光共振能量转移(FRET)的改变。FRET是能量通过非辐射的偶极到偶极的偶联，从激发的供体荧光团转移到受体荧光团的过程。该能量传递的效率高度依赖于供体和受体荧光团之间的距离(例如，对CFP/YFP而言<10nm)和相对方向。但是，高容量筛选方法中，基于FRET的生物感应器要求至少具有4个过滤器的探测设备，其中2个用于激发，2个用于发射。此外，由于探测信号的强度低，探测信号范围和筛选敏感性也低。最后，使用大于1个荧光发射信号，要求使用更多算法以正确地分析最终信号。

因此，仍存在开发用于在活细胞动态环境中实时测量第二信号浓度的改进方法。

发明内容

本发明的第一个方面，涉及一种荧光融合多肽，能够在细胞质中的第二信使浓度增加时，将自己在细胞中的定位从细胞质膜转移至滞留囊泡中，所述多肽包含膜定位肽、第二信使转导蛋白结合肽、内质网滞留信号和荧光肽，其中：

a.所述膜定位肽位于所述荧光融合多肽的N端，且物理性地连接在所述荧光肽上，可选地，所述连接是通过连接子；而所述荧光肽物理性地连接在所述第二信使转导蛋白结合肽上，可选地，所述连接是通过连接子；以及

b.所述第二信使转导蛋白结合肽物理性地连接在所述内质网滞留信号上，可选地，所述连接是通过连接子，而所述内质网滞留信号位于所述荧光融合多肽的C端。

在本发明第一方面的另一个优选实施例中，所述膜定位肽是如SEQ ID 17所示的白细胞介素-2受体的胞外域，或根据氨基酸同源性与所述序列整个区域具有至少90％同源性的变体；以及，所述内质网滞留信号是选自KDEL、HDEL、KKXX、KXKXX和RXR的多肽，其中X为任意氨基酸，且优选地，所述内质网滞留信号是KDEL。

本发明第一方面的更优选实施例中，所述第二信使转导蛋白结合肽是cAMP转导蛋白结合多肽、钙转导蛋白结合多肽、IP3转导蛋白结合多肽、cGMP转导蛋白结合多肽或甘油二脂转导蛋白结合多肽。因此，在本发明的一个更优选的实施例中，本发明第一方面的荧光融合多肽能够在细胞质中的第二信使浓度增加时将自己在细胞中的定位从细胞质膜转移至滞留囊泡中，且所述第二信使选自：钙、IP3、cAMP或甘油二酯。本发明的第二方面中，涉及一种荧光融合多肽，所述多肽能够在胞内钙浓度增加时，将自己在细胞中的定位从细胞质膜转移至滞留囊泡中，所述多肽包括膜定位肽、包含钙调素结合序列的第二信使转导蛋白结合肽、内质网滞留信号和荧光肽，其中：