[发明专利]用于转化猪肺炎支原体的载体，转化的猪肺炎支原体菌株及其用途

说明书

本发明涉及猪肺炎支原体突变株，以及用于制备所述突变株的方法。其还涉及用于所述方法的载体、疫苗组合物以及包含用于针对猪地方性肺炎和其他猪疾病的所述突变株的接种试剂盒。本发明还涉及将猪肺炎支原体作为用于表达重组蛋白质和其他目的DNA序列的宿主的应用。

技术领域

本发明属于开发猪肺炎支原体的遗传操作的方法和工具的领域，其 目的是制备所述细菌种的可用作针对猪疾病的疫苗的经转化的突变株。

发明背景

在兽医领域中，由诸如细菌、病毒或寄生虫等微生物引起的疾病导 致动物死亡或导致生长或增肥过程低效率，从而带来严重的经济损失。

一种保护动物免于未来感染的方法包括施用疫苗以产生免疫应答。

直至现在，基于失活微生物或活的减毒微生物的疫苗已经成为控制 或消灭大多数传染病的主要免疫学基础。

然而，虽然这些类型的疫苗得到好的结果，但是它们存在一些问题， 诸如减毒疫苗可能恢复病毒性、无法将经接种的动物与感染动物区分开 来，或者难以获得针对所有疾病都有效的疫苗。

开发微生物遗传操作的工具通常允许制备比上述疫苗更有效的疫 苗，例如，亚单位疫苗、经遗传修饰的失活疫苗或活疫苗、标记疫苗(DIVA) 或DNA疫苗。

然而，并非兽医领域所有引起疾病的微生物都可容易地进行遗传操 作。

支原体是难以在遗传水平进行操作的微生物。

支原体属于柔膜菌纲，是与革兰阳性菌密切相关的广泛类群的微生 物。

支原体具有小的环形基因组，大小一般小于1,000kb，基因数范围为 500-1000。

可能由于它们适应寄生生活方式，该类细菌还缺乏许多在所有活生 物体中经常发现的代谢通路。结果，支原体是在液体和固体培养基中都 难以培养的难养微生物。

支原体包括猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)(下文中称为 “Mhyo”)，其是在猪产业中造成巨大经济损失的细菌。虽然大多数猪肺 炎支原体感染不严重，但是被猪肺炎支原体感染的动物容易受到呼吸系 统的二次感染，后者可降低每日体重增长速率或甚至导致死亡。

猪肺炎支原体是世界范围内广泛传播的慢性呼吸疾病——猪地方性 肺炎(下文中称为“PEP”)——的病原体。该疾病的特征是高发病率和 低死亡率。PEP的流行度在增肥猪中特别高，并且临床症状的严重程度 取决于引起感染的猪肺炎支原体菌株、环境条件、动物的健康条件以及 由其他病原体导致的二次感染的发作。在一些情况下，PEP以亚临床的 方式存在，没有明显的临床症状。在没有并发症的情况下，该动物显示 与降低每日体重增加速率相关的慢性、非痰性咳嗽，随后降低饲料转化 效率。当发生二次感染时，临床症状变得更加明显，存在急性呼吸症状 和发热，其甚至可引起动物死亡。然而，即使没有由于二次感染导致的 并发症，PEP也由于低饲料转化率和来自医疗的成本而导致严重的经济 损失。一旦在农场发生该疾病，其通过咳嗽生成的气溶胶横向地传递给 其他动物，并且从繁殖的母猪纵向传递给小猪。

除了难以培养外，由于几乎没有可用的工具，支原体的遗传操作受 阻。

支原体特别是猪肺炎支原体的遗传操作中的困难已经在现有技术中 有描述。

猪肺炎支原体菌株232的基因组序列描述于Minion等的文章，The GenomeSequence of Mycoplasma hyopneumoniae Strain 232,the Agent of SwineMycoplasmosis,J.Bacteriol.,2004,186(21),7123-7133。作者称，猪 肺炎支原体是难养的微生物，并且缺乏用于转化猪肺炎支原体的工具和 操作方案。