[发明专利]通过等位基因替代生成FMDV抗性牲畜

权利要求书

1.一种体外细胞，其包含对eIF4G基因的修饰或表达外源eIF4G基因的核酸。

2.权利要求1所述的细胞，其具有表达相对于动物的野生型eIF4G蛋白变化的eIF4G蛋白的eIF4G基因，所述eIF4G蛋白对口蹄疫病毒酶的蛋白酶的切割有抗性。

3.权利要求1或2所述的细胞，其选自由猪、鱼、兔、牛、鸡、山羊和绵羊组成的组。

4.权利要求1-3任一项所述的细胞，其进一步包含由修饰的eIF4G基因表达的eIF4G蛋白。

5.一种分离的核酸，其编码对口蹄疫病毒酶的蛋白酶的切割有抗性的eIF4G蛋白同种型。

6.一种筛选口蹄疫抗性存在的方法，其包括检测细胞，胚胎，或动物以确定它是否包含修饰的eIF4G基因和/或修饰的eIF4G蛋白。

7.一种产生遗传修饰的生物体的方法，其包括：

a.在体外改变细胞、原代细胞、或胚胎的天然eIF4G基因，并克隆原代细胞或将胚胎移植入母体动物中，其中eIF4G基因被改变为表达抵抗口蹄疫蛋白酶的蛋白水解的eIF4G同种型；或

b.在体外将外源eIF4G基因的表达添加至原代细胞或胚胎中，并克隆原代细胞或将胚胎移植入母体动物中，其中外源eIF4G基因表达抵抗口蹄疫蛋白酶的蛋白水解的eIF4G同种型；或

c.(a)和(b)两者。

8.权利要求7所述的方法，其包括将下列各项导入到原代细胞或胚胎中：

a.编码特异性切割天然eIF4G基因中的位点的位点特异性核酸酶的核酸；以及

b.至少包含eIF4G基因的一部分的核酸模板，其中模板提供天然eIF4G基因的备选等位基因，所述备选等位基因编码对口蹄疫病毒酶的蛋白酶的切割有抗性的eIF4G同种型。

9.权利要求7或8所述的方法，其中位点特异性核酸酶选自由锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)和成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)构成的组。

10.通过权利要求7-9中任一项的方法制备的动物。

11.一种遗传修饰的牲畜动物，其包括对eIF4G基因的基因组修饰。

12.权利要求11所述的动物，其中修饰包括eIF4G基因的一个或多个碱基的插入、缺失、或取代。

13.权利要求11或12所述的动物，其中eIF4G基因表达相对于动物的野生型eIF4G蛋白改变的eIF4G蛋白，以对口蹄疫病毒酶的蛋白酶的切割有抗性。

14.权利要求11-13中任一项的动物，其中eIF4G基因表达相对于动物的野生型eIF4G蛋白改变的eIF4G蛋白，以对口蹄疫病毒酶的前导蛋白酶(L^pro)的切割有抗性。

15.权利要求11-14中任一项的动物，其中eIF4G基因表达相对于动物的野生型eIF4G蛋白改变的eIF4G蛋白，以对口蹄疫病毒酶的病毒编码3C蛋白酶(3C^pro)的切割有抗性。

16.权利要求11-15中任一项的动物，其选自由猪、鱼、兔、牛、鸡、山羊和绵羊组成的组。

17.权利要求11-16中任一项的动物，其中动物来自于第一品种，且基因组修饰是在动物的另一个品种中发现的eIF4G基因的天然等位基因。

18.权利要求11-16中任一项的动物，其中所述动物来自第一物种，且基因组修饰是第二物种的另一个品种中的eIF4G基因的等位基因。

19.权利要求11所述的动物，其中所述动物是修饰的eIF4G基因上纯合的。

20.权利要求11-19中任一项的动物，其为建立者动物。

21.权利要求11-20中任一项的动物，其进一步包含由修饰的eIF4G基因表达的eIF4G蛋白。

22.权利要求11-21中任一项的动物，其对口蹄疫有抗性。

23.权利要求11-22中任一项的动物，其中修饰的eIF4G蛋白被修饰以阻止L^pro和/或C^pro的结合。