[发明专利]通过等位基因替代生成FMDV抗性牲畜

说明书

相关申请的交叉引用

本专利申请要求2013年3月15日提交的美国专利申请号No.13/836,860，以及2012年7月31日提交的美国临时申请号US61/677904的优先权，两者通过引用并入本文。

技术领域

技术领域涉及遗传修饰的动物及相关技术。

背景技术

感染口蹄疫病毒(FMDV)的偶蹄类动物由于急性水疱病变得迅速丧失行为能力。牛和猪的FMD感染引起发热，痛性起泡，跛行以及食欲丧失。如感染原的名字所暗示的，经常会发生足部的二次感染，引起慢性跛行以及延迟愈合，类似地乳腺炎在奶牛中可为常见的结局。该疾病的急性阶段持续大约一周后在面对上升的免疫应答时消退，其中的抗体反应显得尤其重要，因为它从血流中高效地清除病毒。由于导致循环衰竭的心肌感染，死亡可发生在年轻动物中。该疾病为如此的高度传染性以至于在单个动物中的感染需要对整个牲畜群进行毁灭和掩埋。因此FMDV被认为是世界上驯养的农场动物(domesticated farm animals)的最重要病原体。2001年在英国FMD的爆发造成了约$40-120亿的总损失[1]，以及十多年前美国加州大学戴维斯分校估计仅在加利福尼亚州的FMD爆发由于动物流动和售卖上的限制，在控制花费和市场丢失上可能花费了$60-140亿。牛奶、和其他产品以及肉类的售卖被停止，并且在相关行业中生产者和工人们的职位会丢失或被严重缩减。其他国家的经济影响是成比例的。

发明概述

本文中记载了抗FMDV的动物。该动物可通过仅最小核苷酸改变且在精确位置进行改变而不对动物基因组进行其他改变而产生。

本发明的一个实施方式是遗传修饰的动物，其包括对eIF4G基因的基因组修饰。该修饰可以包括例如eIF4G基因的一个或多个碱基的插入、缺失，或者取代。eIF4G基因可以改变为表达出相对于动物野生型eIF4G蛋白改变的eIF4G蛋白以对口蹄疫病毒酶的蛋白酶的切割有抗性，所述蛋白酶例如下列一个或两个：口蹄疫病毒酶的前导蛋白酶(Lpro)以及口蹄疫病毒酶的病毒编码3C蛋白酶(3Cpro)。动物可以是哺乳动物。动物可以是实验室研究动物(例如，实验用小鼠、大鼠、狗、或猪物种(例如小型猪))。动物还可以是牲畜动物，例如，选自由猪、鱼、兔、牛、鸡、山羊和绵羊构成的组。在一些情况下，动物来自第一品种，遗传修饰是动物另一个品种中发现的eIF4G基因的天然等位基因。在另一种情况下，动物来自第一物种，遗传修饰是第二物种(人或非人动物)的另一品种中eIF4G基因的等位基因。一般而言，等位基因不是整个基因，而是编码介导FMDV蛋白酶结合以及蛋白水解的蛋白部分的基因。动物可以是修饰的eIF4G基因上纯合性的或杂合性的。动物可以是建立者动物(founder animal)或建立者动物的后代，即可产生动物的新品种或品系。动物可以含有由修饰的eIF4G基因表达的eIF4G蛋白。动物可以对口蹄疫有抗性。经修饰的eIF4G蛋白可经修饰以阻止Lpro和Cpro中一个或两个的结合。

本发明的一个实施方式是产生遗传修饰生物体的方法，其包括体外改变原代细胞(primary cell)或者胚胎(或在胚胎情况下在子宫中)的天然eIF4G基因，并克隆原代细胞或将胚胎移植到母体动物中(代孕者(surrogate))，其中eIF4G基因改变为表达抵抗口蹄疫病毒蛋白酶的蛋白质水解的eIF4G同种型(isoform)。该方法可以涉及用位点特异性核酸酶和核酸模板转染原代细胞或胚胎，所述位点特异性核酸酶特异性切割天然eIF4G基因中的位点，所述核酸模板至少包含eIF4G基因的一部分，其中模板提供了天然eIF4G基因的备选等位基因，所述备选等位基因编码对口蹄疫病毒酶的蛋白酶切割有抗性的eIF4G同种型。位点特异性核酸酶的例子是选自由锌指核酸酶(ZFN)，转录激活因子样效应物核酸酶(transcriptional activator-like effector nuclease，TALEN)，以及成簇规律间隔短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat)(CRISPR或有时称为CRISPR/Cas9)组成的组中的基于核酸酶的系统。