[发明专利]检测生物样品中DNA、RNA和蛋白质的方法

权利要求书

1.探测生物样品中的多种靶标的方法，包括以下步骤：

(a) 使用与RNA靶标直接或间接结合的标记的核酸探针，使所述样品经历原位杂交反应；

(b) 观察来自与RNA靶标结合的所述标记的探针的信号；

(c) 任选地去除来自所述标记的探针的信号；

(d) 使所述样品经历抗原修复方案，以修复所述样品的蛋白质表位；

(e) 使用基于抗体的方法使所述样品经历原位杂交反应并将一种或多种抗体探针与所述样品上的抗原连接；

(f) 观察来自所述一种或多种抗体探针的信号；

(g) 去除来自所述抗体探针的信号；

(h) 任选地应用蛋白酶处理以接近所述样品的DNA靶标；

(i) 使用直接或间接标记所述样品的一种或多种DNA靶标的标记的核酸探针使所述样品经历原位杂交反应；

(j) 观察来自所述标记的DNA靶标的信号；

(k) 任选地去除来自一种或多种标记的DNA靶标的信号。

2.权利要求1的方法，其中在步骤(a)中使用标记的核酸探针的原位杂交反应包括与靶向相同RNA靶标的多种探针杂交。

3.权利要求1的方法，其中步骤a进一步包括封闭DNA的预杂交步骤，在所述杂交反应中使用封闭剂，或其组合。

4.权利要求1的方法，其中在观察来自与RNA靶标结合的标记的探针的信号后，所述样品经历步骤c，并且用针对不同RNA靶标的其它标记的核酸探针将步骤a、b和c重复一次或多次。

5.权利要求1的方法，其中使用基于抗体的方法的原位杂交反应包括免疫组织化学(IHC)或免疫荧光(IF)技术。

6.权利要求5的方法，其中抗体探针包含超过一种探针的混合物。

7.权利要求6的方法，其中所述混合物包含2-10种探针。

8.权利要求5的方法，其中至少一种抗体探针与酶标记、荧光信号发生器或其组合缀合。

9.权利要求5的方法，其中在观察和去除来自所述一种或多种抗体探针的信号后，用针对不同抗原的另一抗体探针将步骤e、f和g重复一次或多次。

10.权利要求1的方法，进一步包括在蛋白酶处理后保持组织形态学、预杂交或其组合的步骤。

11.权利要求1的方法，其中步骤(i)中的原位杂交包括用基于核酸的结合剂处理以形成沃森-克里克键、Hoogsteen键或其组合。

12.权利要求11的方法，其中所述核酸结合剂的长度范围为约4个核苷酸至约1000个核苷酸。

13.权利要求12的方法，其中所述核酸结合剂的长度范围为约12个核苷酸至约400个核苷酸。

14.权利要求1的方法，其中在观察来自与DNA靶标结合的标记的探针的信号后，用针对不同DNA靶标的另一标记的核酸探针将步骤I、j和k重复一次或多次。

15.权利要求1的方法，其中在步骤c、g和i中信号的去除包括信号灭活剂、光反应、光活化化学漂白、探针剥离、氧化、电子转移或其组合。

16.权利要求1的方法，进一步包括用一种或多种对照探针对所述样品染色以允许记录样品的多个图像。

17.权利要求16的方法，其中所述对照探针是形态学染色剂。

18.权利要求16的方法，进一步包括记录样品的多个图像，其中记录包括：

从步骤b、f、j或其组合获得样品的多个图像；

按照自对照探针检测的信号，比对和覆盖多个图像。

19.权利要求18的方法，进一步包括根据覆盖的图像来分析蛋白质、RNA和DNA的表达的步骤。

20.权利要求1的方法，进一步包括测定在观察步骤b、f、j或其组合中观察到的一种或多种信号强度值。

21.权利要求20的方法，其中测定一种或多种信号强度值包括信号放大技术。

22.权利要求21的方法，其中所述信号包括荧光信号、显色探针或其组合。