[发明专利]检测生物样品中DNA、RNA和蛋白质的方法

说明书

背景

多种不同方法可用于生物学和医学中，以观察生物样品中的不同靶标。例如，组织切片和其它细胞制备物中的蛋白质分析可使用组织化学、免疫组织化学(IHC)、或免疫荧光的技术来进行。

重复分析单个样品的方法描述于美国专利号7,629,125和美国专利号7,741,046。具体地讲，美国专利号7,741,046提供了检测生物样品中的多个靶标的方法，其包括利用氧化以灭活信号发生器(例如，漂白荧光染料)。

蛋白质和DNA靶标的原位检测常规用作癌症控制的诊断工具。近年来已经开发了在相同组织切片中同时检查这些靶标的方法，以测定这些标记彼此的相关性以及这些标记与临床参数的相关性。另一重要的细胞靶标是RNA。已经鉴定了多种不同的RNA种类，除了作为蛋白质合成的模板外，它们中的许多例如miRNA还控制基因表达并因此控制细胞功能和/或疾病进程。RNA稳定性提出了独特的挑战性并且通常需要极其谨慎以防RNA酶污染。因此适当的是在过程早期进行RNA检测。然而，在福尔马林固定的石蜡包埋的组织中进行RNA检测的现有方法通常是在广泛蛋白酶处理后进行，这与蛋白质靶标的下游检测不相容。

本文公开的是检测RNA种类的方法，无需蛋白酶处理并且在相同样品中同时检测3种靶标：蛋白质、DNA和RNA。每种靶标在正常细胞功能和疾病进程中起到重要作用并且需要特定的样品制备物，其不必与所有靶标相容。在相同样品中的原位检测将允许更好地测定这些不同靶标的表达之间的相关性和更好地分析它们与疾病的关系。

简述

本文公开的是探测生物样品中的多种靶标的新方法，其中所述靶标是DNA、RNA和蛋白质。

在某些实施方案中，公开了包括多个步骤的探测生物样品中的多种靶标的方法。所述步骤包括使用与RNA靶标直接或间接结合的标记的核酸探针，使所述样品经历原位杂交反应，观察来自与RNA靶标结合的标记的探针的信号，和任选地去除来自所述标记的探针的信号。所述方法进一步包括使所述样品经历抗原修复方案的步骤，以修复所述样品的蛋白质表位，使用基于抗体的方法使所述样品经历原位杂交反应并将一种或多种抗体探针与所述样品上的抗原结合，观察来自所述一种或多种抗体探针的信号，去除来自所述抗体探针的信号，任选地应用蛋白酶处理以接近所述样品的DNA靶标，使用直接或间接标记所述样品的一种或多种DNA靶标的标记的核酸探针使所述样品经历原位杂交反应，观察来自所述标记的DNA靶标的信号，和任选地去除来自一种或多种标记的DNA靶标的信号。

在某些实施方案中，所述方法进一步包括用一种或多种对照探针对所述样品染色以允许记录样品的多个图像和任选地记录样品的多个图像。再其它实施方案包括根据多个图像来分析蛋白质、RNA和DNA的表达的方法。

附图描述

图1是探测生物样品中的多种靶标的方法的示意图，其中所述靶标包括RNA、DNA和蛋白质。

图2a显示II级肺鳞状细胞癌的多重RNA、蛋白质和DNA染色，A：细胞核用DAPI染色，B: U6 RNA, C: EGFR, D: 细胞角蛋白7, E: IGF1R, F: NaKATP酶, G: cMET和H: EGFR。

图2b, 图组I & J是图2a的图组G & H的相同视野切片的放大：未观察到明显的cMET染色。

图3a显示肺转移性腺癌的多重RNA、蛋白质和DNA染色。A: 细胞核用DAPI染色，B: U6 RNA, C: EGFR, D: 细胞角蛋白7, E: IGF1R, F: NaKATP酶, G: cMET和H: EGFR。

图3b, 图组I & J是图3a的图组G & H的相同视野切片的放大。

发明详述

为更清楚和简明地阐述并指出所要求保护发明的主题，对下文描述和所附权利要求书中使用的特定术语提供了以下定义。