[发明专利]单分子蛋白测序

说明书

技术领域

本发明涉及用于确定蛋白的类型(通过测序)的(单分子)方法，以及可以用于这种方法的装置。

背景技术

用于单分子蛋白分析的方法在本领域中是已知的。例如，WO2010065531描述了这种方法可以用于发现新的生物标记物、定量以及高通量筛选。可以表明的是，使用改进的埃德曼降解(Edman degradation)，随后通过检测(例如，标记物的抗体检测)，能够直接测序表面结合肽。使用分子(例如，标记物的抗体)的池(pool)以识别和定量生物样品中的各种蛋白分析物，能够实现高通量筛选。

进一步地，WO2010144151描述了用于进行其中发生蛋白合成的分析反应的单分子、实时分析的组合物、方法和系统。分析这种反应的能力提供了研究这些反应以及潜在地识别因子的机会和/或用于影响这种反应的方法，例如，增强、抑制或以其他方式影响这种反应，包括但不限于影响反应速率、持续合成能力(processivity)、保真度(精确度，fidelity)、持续时间等。该文献特别描述了测定由靶mRNA分子编码的氨基酸的序列的方法，包括：a)提供包含靶mRNA分子的反应混合物、在P位点包含tMet-tRNA tMet的核糖体复合物、以及在溶液中游离的多种类型的标记物的氨酰基-tRNA，其中，核糖体和/或靶mRNA分子固定在载体上，使得观察体积包括不超过一个核糖体和/或mRNA分子，并且进一步地，其中，核糖体复合物不包括可检测的标记物或淬灭基团；b)通过核糖体复合物引发mRNA分子的连续翻译；c)在所述连续翻译过程中，顺序地并且可选地检测核糖体复合物与至少一个第一标记物的氨酰基-tRNA和第二标记物的氨酰基-tRNA的关系，其中，所述关系导致来自第一标记物的氨酰基-tRNA的第一氨基酸和来自第二标记物的氨酰基-tRNA的第二氨基酸结合在新生多肽链中；以及d)识别第一氨基酸和第二氨基酸，从而确定由靶mRNA分子编码的氨基酸的序列。

发明内容

蛋白是生命的基础，因为它们是所有生命形式的工作机器。为了理解生物现象，需要具有所涉及的蛋白的综合知识。确定蛋白的氨基酸的序列的蛋白测序用于获得从细胞系到细胞组织到生物个体的蛋白种群的谱图(profile)。由于1950年的胰岛素的首次蛋白测序，测序技术已经稳定演化成开启了蛋白组学、细胞蛋白谱图全面绘制的纪元。

现代的蛋白测序主要基于质谱技术(ESI、MALDI等)。各自具有其自身的优点和缺点，但它们均共享相同的限制。第一，它们可以仅分析蛋白片段(约10-20个氨基酸)。当检查全长蛋白(通常，几百个氨基酸长)时，计算的复杂化阻止了精确的序列预测。第二，由于通过分析复杂的谱峰进行序列预测，使得它们通常不能识别嵌入在其他主要物质(物种，species)之间的次要物质。由于许多细胞蛋白以低丰度存在，这使得难以获得大规模的蛋白组学信息。

在DNA测序中，面临类似的挑战，但当扩增DNA样品直至达到高信噪比时，克服了它们。不同于DNA，不存在可以扩增蛋白的天然系统(机器，machinery)。在此，我们的目的在于：在与大规模技术一样高的精度并且使用与单细胞一样小的样品数量下，开发可以量化细胞蛋白的全新的方法。

因此，本发明的一个方面是提供用于确定蛋白的类型的可替换的(单分子)(测序)方法和/或用于确定蛋白的类型的可替换的装置(尤其适用于这种可替换的(单分子)的方法)，其中，所述方法和/或装置优选进一步至少部分避免上述限制中的一个或多个。

因此，提出了使用(在一个实施方式中)单分子荧光技术的新测序方法。该新方法将分子接分子地探索蛋白，而不仅仅是取它们的平均；因此，尽管细胞蛋白的复杂的性质和宽动态范围，但其可以覆盖全部蛋白。不同于基于质谱的测序，该方法将读取全长蛋白序列，这将使得测序预测更不容易出错。单分子检测如此敏感使得该方法可以仅需要小量的用于分析细胞蛋白的样品(不超过1fmol)。这将产生用于单细胞分析的机会。这些优点与通常需要大于10³-10⁵倍的用于分析的蛋白的质谱的限制相比。