[发明专利]经修饰的宿主细胞的建立方法

说明书

本发明的课题是建立作为重组蛋白质生产中使用的宿主细胞有用的，稳定地高表达导入基因，稳定增殖的细胞株。由本发明提供建立可使2个以上的外来基因稳定地表达的用于重组蛋白质生产的细胞株的方法，其包括向细胞导入抑制NfkBia的表达的非编码RNA的基因。

【技术领域】

本发明涉及使用培养动物细胞的重组蛋白质的制造，更具体而言涉及建立如可有效制造目的蛋白质的宿主细胞的技术。

【背景技术】

使用基因重组技术生产作为医药有用的蛋白质时，使用动物细胞，则由于原核细胞实现不了的复杂的翻译后修饰或折叠变得可能，从而动物细胞作为用于重组蛋白质生产的宿主细胞而多用。

近年、抗体或生理活性蛋白质等的多种生物药品辈出，但在动物细胞中有效生产重组蛋白质的技术与生物药品的低成本化连系，约束向患者的稳定的供给。

从而，期望生产效率更高的蛋白质的制造方法。

知通过向宿主细胞，除目的蛋白质的基因之外，导入其他结构基因而使以高的表达量表达，从而使目的蛋白质的生产效率升高的技术。

例如，公开有包括培养高表达作为膜输送蛋白质的牛磺酸转运子(TauT)基因、并且导入编码希望得到的蛋白质的DNA的细胞的蛋白质的制造方法(专利文献1：WO2007/119774、专利文献2：WO2009/051109)。

另外公开有，通过使用导入作为牛磺酸合成途径的酶的半胱氨酸亚磺酸脱羧酶(CSAD)基因的细胞来增加希望得到的蛋白质的生产量(专利文献3：WO2008/114673)。

另外公开有，通过使用导入丙氨酸氨基转移酶(ALT)基因的细胞而使希望得到的蛋白质的生产量增加(专利文献4：WO2009/020144)。丙氨酸氨基转移酶是使从丙氨酸生成谷氨酸的酶，也被知为人肝细胞中含的酶GTP(谷氨酰胺-丙酮酸转氨酶)。

另外公开有，通过使用导入有碳酸氢根转运子功能的阴离子交换剂(AE)的基因的细胞而使希望得到的蛋白质的生产量增加(专利文献5：WO2009/054433)。

再公开有，CSAD和TauT的共表达、ALT和TauT的共表达、碳酸氢根转运子和CSAD、或者碳酸氢根转运子和ALT的共表达结果，更加增加希望得到的蛋白质的生产量(专利文献3-5)。

但是，本发明人，从至今的研究发现，向宿主细胞导入2种外来基因时，即使是名自单独导入则可建立该基因稳定地表达的细胞株的情况，也有无法建立使所述2种外来基因一同稳定地高表达的细胞株的情况。此时，与至少一方的所述外来基因相同的基因或对应基因的在宿主细胞的表达量用qPCR在检测限界以下时，导致无法建立使2种基因一同稳定地高表达的细胞株。特别是，有相同的功能的蛋白质的基因或与相同的代谢系统反应相关的酶的基因、例如，使2种膜输送蛋白质一同高表达的宿主细胞或使2种酶一同高表达的宿主细胞的建立是不可能的。另外，GlycArt公司的2种糖链关联酶基因在宿主细胞中表达，但再使高表达的宿主细胞来源的抗体产生细胞由于酶基因表达不稳定，见到抗体的无岩藻糖基含量脱离期待的范围的事例。

如此，使不同的2种以上的基因高表达伴随多个困难。

【现有技术文献】

【专利文献】

专利文献1：WO2007/119774

专利文献2：WO2009/051109

专利文献3：WO2008/114673

专利文献4：WO2009/020144

专利文献5：WO2009/054433

【发明内容】

【发明要解决的技术课题】