[发明专利]用于测定神经毒素多肽的生物学活性的细胞测试系统

权利要求书

1.生成神经毒素敏感的、神经元分化的细胞的方法，所述方法包括步骤为：

a)在引发所述肿瘤细胞神经元分化的条件和时间下，在培养基中培养能够分化为神经元细胞的肿瘤细胞，其中肿瘤细胞是SiMa细胞；和

b)在具有120至250mOsm/kg的重量摩尔渗透压浓度，并且包含(i)B27补充物和/或(ii)N2补充物的分化培养基中培养a)的经引发神经元分化的肿瘤细胞至少3天，从而较之在具有290至350mOsm/kg的重量摩尔渗透压浓度的分化培养基中培养的SiMa细胞，获得对梭菌神经毒素BoNT具有增加的敏感性的神经毒素敏感的、神经元分化的细胞。

2.权利要求1的方法，其中分化培养基还包含视黄酸。

3.权利要求2的方法，其中所述视黄酸以0.01μM和300μM之间的浓度存在。

4.权利要求1的方法，其中分化培养基还包含抗菌剂和/或抑制非神经元细胞生长的细胞抑制剂。

5.权利要求1的方法，其中分化培养基还包含GT1b。

6.权利要求5的方法，其中所述GT1b以25和75μM之间的浓度存在。

7.权利要求5的方法，其中所述GT1b以50μM的浓度存在。

8.权利要求1的方法，其中在权利要求1a)中引发所述细胞神经元分化的所述条件和时间包括从培养基中降低血清和/或添加视黄酸。

9.权利要求1的方法，其中所述肿瘤细胞是SiMa细胞DSMZ ACC保藏号:164。

10.权利要求1或9的方法，其中步骤a)中的培养基包含80至98.8％OptiMEM、1至10％FBS、0.2至5％B27补充物和/或0.2至5％N2补充物和，任选地，非必需氨基酸和/或抗菌素。

11.权利要求1或9的方法，其中步骤b)中的分化培养基具有200至225mOsm/kg的重量摩尔渗透压浓度。

12.权利要求11的方法，其中步骤b)中的分化培养基包含78至98.3％neurobasal培养基，1至10％FBS，0.5至2％GlutaMAX，0.2至5％B27补充物，和/或0.2至5％N2补充物。

13.权利要求1或9的方法，其中在步骤a)中培养SiMa细胞至少36小时。

14.权利要求1或9的方法，其中步骤a)中的所述培养基还包含抗菌剂和/或非必需氨基酸(NEAA)。

15.权利要求1或9的方法，其中在步骤a)中在组织培养皿上培养SiMa细胞，所述组织培养皿用至少一种选自以下组成的组的化合物包被：聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、胶原蛋白、层粘连蛋白和明胶。

16.用于测定神经毒素多肽的活性的方法，所述方法包括步骤为：

a)通过权利要求1至15之任一项的方法获得神经毒素敏感的、神经元分化的细胞，使该细胞与神经毒素多肽相接触；

b)在允许神经毒素多肽发挥其生物学活性的条件下培养步骤a)的神经毒素敏感的、神经元分化的细胞3至74小时；和

c)在根据步骤b)培养后，测定所述细胞中神经毒素多肽的生物学活性。

17.权利要求16的方法，其中在步骤b)中，在允许神经毒素多肽发挥其生物学活性的条件下培养步骤a)的神经毒素敏感的、神经元分化的细胞72小时。

18.根据权利要求1的方法，其中步骤a)中的培养基包含93.5％OptiMEM、5％FBS,1％B27补充物和0.5％N2补充物。